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背景与目的:恶性室性心律失常是导致心源性猝死(SCD)的主要原因,但因其诱发因素繁多、发病机制不详,难以得到有效的预防及治疗。其中临床常见的获得性长QT综合征(aLQTS)致尖端扭转型室性心动过速(TdP)是导致SCD的重要原因之一。大量研究证实,阻滞hERG(即KCNH2)基因所编码的快速激活延迟整流钾电流(IKr)通道时,可引起外向钾电流减少,使心肌细胞复极延长,易产生TdP。近年来,有研究表明,微小RNA(miRNA)表达水平异常,可引起离子通道蛋白表达紊乱,导致离子通道失衡,诱发心律失常。本研究组前期已通过双荧光素酶基因报告法从最初预测的6个miRNA(miR-134、miR-143、miR-103、miR-147、miR-185、miR-3619)中,初步筛选出4个与hERG基因有相关性(miR-134、miR-143、miR-103、miR-3619)。本实验旨在进一步验证所筛选miRNA与hERG基因的相关性,并以hERG基因为靶点,探讨miRNA对其功能的影响,为aLQTS发生机制的研究提供新的思路。方法:1.将WT-hERG转染至U2OS细胞中,用浓度为400μg/ml G418筛选出稳定表达WT-hERG的单克隆细胞;2.用miRNA及其相应的反义寡核苷酸序列(AMOs)对hERG-U2OS细胞模型进行干预;3. RT-PCR检测miRNA对hERG基因相关mRNA表达的影响,western blot检测miRNA对hERG基因相关蛋白质表达的影响,激光共聚焦检测miRNA对hERG基因相关蛋白质定位的影响。结果:Western blotting结果显示,用400μg/ml G418筛选出的转染WT-hERG的U2OS细胞,可见两条明显的蛋白质条带,分别表示hERG基因所表达的滞留于内质网内的不成熟核心糖基化蛋白(135kD蛋白质条带)和位于细胞膜上、完全成熟的糖基化蛋白(155kD蛋白质条带),表明hERG-U2OS稳定表达细胞株构建成功。分子生物学相关实验结果如下:1. RT-PCR结果显示: miR-134、 miR-143、 miR-103、 miR-3619过表达可使hERG相关mRNA相对表达量较对照组下调;用相应的AMOs拮抗miRNAs, hERG相关mRNA相对表达量较对照组无明显变化; miR-147、 miR-185作用下hERG相关mRNA相对表达量较对照组无明显改变;2. Western blot结果显示: miR-134、 miR-143、 miR-103、 miR-3619过表达可使hERG相关蛋白质表达较对照组下调;用相应的AMOs拮抗miRNAs, hERG相关蛋白质表达较对照组无明显变化; miR-147、 miR-185作用下hERG相关蛋白质表达较对照组无明显改变;3.激光共聚焦结果显示: miR-134、143、103、3619过表达可使hERG-U2OS细胞胞质内未成熟蛋白及细胞膜上成熟通道蛋白的表达较对照组均降低,用相应的AMOs沉默miRNAs,hERG相关蛋白质表达较对照组无明显变化;而miR-147、185作用后,hERG-U2OS细胞胞内及胞膜上蛋白质表达较对照组均无明显变化。结论:本实验进一步验证了hERG基因是miR-134、143、103、3619的靶基因,证实它们可使WT-hERG基因编码的mRNA、蛋白质表达水平下调,沉默miRNA可拮抗上述所用,从而实现了miRNA对WT-hERG基因的主动调控。