论文部分内容阅读
目的1．建立单次大剂量致大鼠半胸放射性肺损伤的动物模型，动态观察放射性肺损伤的病理形态学变化。2．观察放射性肺损伤肺组织细胞凋亡、Bax、Bcl-2、转化生长因子-β1(TGF-β1)的变化，初步探讨细胞凋亡与放射性肺损伤的关系，为我们找到一条治疗放射性肺损伤的新途径提供部分实验依据。3．观察干扰素-γ(IFN-γ)对放射性肺损伤Bax、Bcl-2、TGF-β1表达及病理形态学的干预作用，为IFN-γ治疗放射性肺损伤提供部分实验依据。方法1．大鼠半胸放射性肺损伤动物模型的建立：用3％戊巴比妥(30ml／kg)腹腔内注射全身麻醉后，大鼠仰卧位固定于老鼠板上，并置于带有呼吸膜的灭菌纸箱内，在X线模拟机下确定照射野(右侧半胸照射)：上界至右肺尖，下界为右肺底，内侧界为胸骨正中线，外侧界至右侧胸廓外缘，射野大小为3.0×5.0cm。用高能X线进行垂直单次照射，源皮距为98.0cm，深度为2.0cm，剂量为30Gy，能量为6MV，剂量率为300cGy／min。2．放射性肺损伤细胞因子及病理学观察：随机分为正常对照组(N)、照射组(A、B、C、D、E)共6组(每组5只)。在放疗后第1、7、14、28、56d共5个时间点活杀1只正常对照组大鼠和1组(5只)实验组大鼠，获取标本行电镜、HE染色比较观察各组肺组织病理形态学变化，免疫组化SP法测Bcl-2、Bax、TGF-β1在各组中的表达。所有病理学观察均由两位病理学专家双盲法作出判断。正常对照组及照射后第1天组大鼠部分肺组织行凋亡指数测定。3．IFN-γ对放射性肺损伤的干预作用：随机分为照射组(C、D)，照射+药物组(I-C、I-D)共4组(每组5只)。从照射当天开始，照射+药物组大鼠予以注射用重组人IFN-γ5万单位腹腔内注射，1／日；单纯照射组予以生理盐水3ml腹腔内注射，1／日。在照射后第14、28d共2个时间点活杀照射组及照射+药物组大鼠各1组，获取标本行电镜、HE染色比较观察各组肺组织病理形态学变化，免疫组化SP法测Bcl-2、Bax、TGF-β1在各组中的表达。所有病理学观察均由两位病理学专家双盲法作出判断。4．统计数据用SPSS13.0软件分析。结果1．放射性肺损伤细胞因子及病理学观察的实验研究：(1)大鼠放射性肺损伤模型病理形态学观察及细胞凋亡：放射性肺损伤的病理变化过程大致经过急性炎症、增生和纤维化三个时期。超微结构观察各个时间点均可见凋亡的Ⅱ型肺泡上皮细胞。照射后第一天的细胞凋亡指数明显高于正常对照组，差异具有显著性(P＜0.001)。提示放射性肺损伤早期并开始发生Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，并在其发展过程中仍可见Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡。(2)Bcl-2、Bax的表达变化：放射性肺损伤肺损伤区细支气管上皮细胞、肺泡上皮细胞Bcl-2表达减弱，但在间质细胞表达明显增强，尤以支气管周围为显著，Bax在肺损伤区肺泡上皮细胞和支气管上皮细胞表达明显增强，在间质细胞表达增强。比较发现，Bax在上皮细胞的表达及Bcl-2在间质细胞的表达高于对照组。各个照射组与对照组比较发现，照射后第7、14、28、56天上皮细胞Bax的表达高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)，照射后第14、28天间质细胞Bcl-2的表达高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)，而Bcl-2在上皮细胞的表达及Bax在间质细胞的表达与对照组相比，无显著性差异。(3)TGF-β1的表达变化：照射后肺中TGF-β1广泛表达于肺泡上皮细胞、血管内皮细胞、支气管上皮细胞及间质细胞。比较发现，照射后第14、28、56天肺TGF-β1的表达高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。2．IFN-γ对放射性肺损伤干预作用的实验研究：(1)IFN-γ对放射性肺损伤病理形态的干预作用：加用IFN-γ组第14天大鼠肺泡炎的表现与单纯对照组比较无明显变化，加用IFN-γ组第28天大鼠肺胶原纤维灶明显减少，儿乎不形成肺纤维化，程度较单纯照射组明显减轻。电镜显示肺泡Ⅱ型上皮细胞仅见板层小体空泡样变，成纤维细胞的增生及间质胶原纤维的沉积不明显，显著轻于单纯照射组。(2)IFN-γ对放射性肺损伤Bcl-2、Bax表达的影响：照射+药物组肺Bcl-2在间质细胞表达减弱，Bax在间质细胞表达有所增强。比较发现，照射+药物组肺间质细胞Bcl-2表达低于单纯照射组，差异具有显著性(P＜0.05)。(3)IFN-γ对放射性肺损伤TGF-β1表达的影响：照射后第28天照射+药物组肺TGF-β1的表达低于单纯照射组，差异具有显著性(P＜0.05)，结论1．大鼠放射性肺损伤模型提示放射性肺损伤的病理改变是一个动态发展的过程，但也可观察到在同一时间点获取的病理存在不同时期的病变。放射性肺损伤早期并开始发生显著Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，并在其发展过程中仍可见Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡，提示Ⅱ型肺泡上皮细胞凋亡在放射性肺损伤的发生、发展中可能发挥了重要的作用。2．放射性肺损伤间质细胞Bcl-2、上皮细胞Bax的表达显著，而上皮细胞Bcl-2、间质细胞Bax的表达不显著。提示上皮细胞的Bax／Bcl-2比值上升，而间质细胞的Bax／Bcl-2比值下降，考虑这种促凋亡因子Bax与凋亡抑制因子Bcl-2的不平衡表达在放射性肺损伤的发病过程中可能起了重要的作用。3．放射性肺损伤可见肺组织中广泛的TGF-β1显著表达，提示TGF-β1在促进上皮细胞凋亡、促进纤维化的形成中可能起了重要的作用。4．形态学可见IFN-γ可以拈抗放射性肺损伤肺纤维化的发生。IFN-γ可明显降低放射性肺损伤肺间质细胞Bcl-2的表达，Bax／Bcl-2比值呈上调趋势，表明IFN-γ可能促进间质细胞的凋亡，从而抑制肺纤维化的形成。IFN-γ可抑制放射性肺损伤肺组织中TGF-β1的表达，从而发挥抗纤维化的作用。