内毒素血症是由G-菌释放的内毒素(又名脂多糖,lipopolysaccharide,LPS)引起的全身炎症反应综合症,是多系统多种疾病的严重并发症,通常导致致死性感染性休克、多器官功能衰竭、弥漫性血管内凝血等,病死率极高。在内毒素血症过程中,脂多糖可以促使吞噬细胞发生呼吸爆发,释放大量超氧阴离子等活性氧(reactive oxygen species,ROS)。研究已经表明,ROS在机体的病理生理过程中起着双重作用,一方面,适量的ROS对机体有重要的保护作用；另一方面,在持续大量的ROS作用下,生物大分子脂质、蛋白质、DNA等会发生氧化损伤,进而与TNF-α、IL等致炎因子共同导致广泛性的组织损伤和器官衰竭,使内毒素血症趋于恶化。　　 SOD是一种普遍存在于生物体中的含金属离子的超氧化物歧化酶,可以催化超氧化物发生歧化反应,清除氧自由基,进而在抗炎、抗氧化应激、抑制肿瘤、自身免疫疾病方面发挥重要作用。SOD2是真核生物SOD的一种亚型,是位于线粒体的锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD,SOD2),线粒体是细胞内能量产生和氧代谢的重要场所,也是自由基产生的场所,由此决定了SOD2在抗氧化损伤中的特殊地位。　　 不同亚型的SOD在生物体中的表达方式不同,其中SOD2在多种组织细胞中均有表达,但更主要的是受细胞内外各种因素的刺激发生诱导型表达。当细胞受到辐射、氧化剂、细胞因子、LPS等刺激时,SOD2表达显着提高,进而使机体免受氧自由基的损伤。因此研究各种刺激因素尤其是LPS诱导的SOD2表达调控机制对深入理解SOD2在细胞保护中的作用具有重要意义。　　 本实验室在前期工作中已经利用DNApull-down技术、差异蛋白DIGE分离、质谱分析等技术,鉴定出了24个可能参与LPS诱导的SOD2基因转录调控蛋白,其中包括NONO。那么,本课题的研究任务是:①验证前期鉴定出的NONO蛋白是否参与了LPS刺激下SOD2的表达调控:②若该蛋白有转录调控作用,再进一步证明其在SOD2启动子序列上的大致结合范围及相关的信号通路。完成该研究任务后的临床意义:理解内毒素血症过程中SOD2高表达的机制,对于发现新的治疗手段很有意义。　　 研究已经表明,SOD2启动子序列缺乏TATA盒、CAAT盒,但转录起始点上游序列富含GC碱基,该序列上有公认的NF-κ「 B结合位点,及已经被证实的SP-1、AP-2结合位点。那么,SOD2启动子序列上是否有NONO蛋白的作用位点及其是否受NONO调控,有待于验证。不包含POU结构域的八聚核苷酸结合蛋白(Non-POU domain-containing octamer-binding protein,NONO)是广泛存在于真核细胞中的重要蛋白之一,在基因表达调控中起重要作用。NONO是多功能核蛋白家族的一个成员,在人类该蛋白称为p54nrb。该家族的蛋白羧基末端有2个保守的RRM(RNA Recognition motif)结构域,可以识别、结合RNA或ssDNA。该结构域由90个氨基酸残基组成,空间上形成2个α-螺旋和4股β-折叠片。NONO除了上述的2个RRM结构域外,还有1个DBD(DNA bindingdomain)结构域,由1个HTH(helix-turn-helix)结构及其后紧跟的1个碱性氨基酸或酸性氨基酸共同组成。这些结构特征为其参与多种核内事件提供了基础。　　 最近越来越多的文献报道,NONO参与不同基因的转录调控。例如,p54nrb/NONO与HMGA1(high mobility group protein A1)、蛋白相关剪切因子(protein-associated splicing factor,PSF)等蛋白形成复合体,共同参与小鼠RBP4(retinol-binding protein)基因的表达调控；NONO可以通过其某一位点氨基酸残基的磷酸化或者借助某些桥梁蛋白参与炎症过程中HASMC(人类大动脉平滑肌细胞)P4Hα1(Prolyl-4-Hydroxylaseα1)的转录调控。　　 综上,依据以下几点,我们推断,NONO也可能参与了LPS诱导的SOD2表达调控:①NONO蛋白结构特征；②文献报道,NONO作为转录因子参与多种基因转录调控的事实；③NONO蛋白是本实验室前期利用多种专业技术从内毒素血症小鼠组织核蛋白中筛选并鉴定出的SOD2启动子结合蛋白。　　 为了证实上述推断及相关的启动子区域和信号通路,我们从以下几方面予以验证:　　 (一)RT-PCR检测LPS对RAW264.7细胞SOD2 mRNA表达的影响采用RT-PCR方法检测LPS刺激对RAW264.7细胞SOD2mRNA表达的剂量效应和时间效应。结果显示,与对照组相比,0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml LPS刺激RAW264.7细胞12h后,SOD2mRNA表达水平均有所增高。以1μg/mlLPS刺激RAW264.7细胞0h,1h,2h,4h,6h,12h后,与对照组相比,SOD2mRNA表达水平在刺激12h后增加最为明显。本实验为进一步探讨LPS刺激下NONO对SOD2表达调控机制奠定了基础。　　 (二)细胞免疫荧光技术检测NONO蛋白在细胞内定位情况为了明确LPS刺激及氧化刺激对NONO蛋白定位的影响,分别对RAW264.7细胞中内源性NONO蛋白及NIH3T3细胞中过表达的NONO蛋白,进行细胞免疫荧光检测。结果显示,静息状态下,内源性NONO蛋白主要分布在RAW264.7细胞核中,胞浆中也有少量分布,LPS刺激后在胞核中聚集更为明显；外源性NONO蛋白在静息状态下分布于NIH3T3细胞浆中,亚砷酸钠刺激1h后移位入核。这些结果证实了NONO蛋白有核内定位现象,为NONO参与核内事件提供了形态学依据。　　 (三)从mRNA水平和蛋白水平检测LPS刺激下NONO对SOD2表达水平的影响　　 1.RT-PCR和Realtime PCR检测NONO在LPS刺激下对RAW264.7细胞中SOD2表达水平的影响。实验分组:①转染pcDNA3-C-HA组；②转染pcDNA3-C-HA后,LPS刺激细胞12h；③转染pcDNA3-NONO-HA组；④转染pcDNA3-NONO-HA后,LPS刺激细胞12h。收细胞,提取总RNA,进行RT-PCR。结果显示,与转染pcDNA3-C—HA对照组相比,LPS刺激和NONO过表达均可增加SOD2的表达,而且NONO过表达还可以进一步增强LPS诱导的SOD2表达水平。　　 2.双荧光素酶报告基因技术检测NONO过表达对SOD2启动子活性的影响。实验分组:①共转染pGL3-control、pcDNA3-C-HA、pRL-TK；②共转染pGL3-sod2p、pcDNA3-C—HA、pRL-TK；③共转染pGL3-sod2p、pcDNA3-NONO-HA、pRL-TK。检测293细胞及NIH3T3细胞中相对荧光素酶活性。结果显示,在两种细胞中,与对照组相比,NONO过表达后,细胞中相对荧光素酶活性均明显增高,说明NONO过表达可以上调SOD启动子活性。　　 3.Western-Blot技术检测LPS刺激下NONO对RAW264.7细胞中SOD2蛋白表达水平的影响。实验分组:①转染pcDNA3-C—HA组；②转染pcDNA3-C-HA后,LPS刺激细胞12h；③转染pcDNA3-NONO-HA组；④转染pcDNA3-NONO—HA后,LPS刺激细胞12h。裂解细胞获取总蛋白,用Western-Blot技术检测各实验组SOD2表达水平。结果显示,LPS刺激下NONO可以提高SOD2表达水平。　　 (四)用RNAi技术检测NONO被干扰后,RAW264.7细胞中SOD2表达水平的变化。　　 为了进一步确定NONO可以上调SOD2表达水平,利用RNAi技术从反面验证NONO表达被干扰后,SOD2表达水平是否下降。实验分组:①转染siRNA-NONO组；②转染siRNA-NC组；③仪用转染试剂处理组；④未加任何处理组。结果显示,与对照组相比,NONO被siRNA干扰后,SOD2表达水平相应下降。　　 至此,我们可以得出以下结论:①NONO可以上调小鼠SOD2启动子活性；②NONO过表达可以增强LPS诱导的SOD2表达。　　 (五)利用双荧光素酶报告基因技术检测参与NONO调控SOD2基因表达的关键启动子区域首先,构建小鼠SOD2启动子不同deletion片段驱动的荧光素酶报告基因载体。将小鼠SOD2启动子从5’端依次递减200bp后,分成8个片段:Ⅰ-1554～+48bp命名为sod2p；Ⅱ-1354～+48bp命名为sod2p-1；Ⅲ-1154～+48bp命名为sod2p-2；Ⅳ-954～+48bp命名为sod2p-3；Ⅴ-754～+48bp命名为sod2p-4；Ⅵ-554～+48bp命名为sod2p-5；Ⅶ-354～+48bp命名为sod2p-6；Ⅷ-154～+48bp命名为sod2p-7。由这8个启动子片段驱动的荧光素酶报告基因载体分别命名为pGL3-sod2p、pGL3-sod2p-1、pGL3-sod2p-2、pGL3-sod2p-3、pGL3-sod2p-4、pGL3-sod2p-5、pGL3-sod2p-6、pGL3-sod2p-7。　　 然后,将8个报告基因载体分别与质粒pGL3-control、pcDNA3-C-HA、pcDNA3-NONO-HA、pRL-TK共转染至293细胞24h后,检测细胞中相对荧光素酶活性。结果显示,与对照组相比,pcDNA3-NONO-HA与SOD2启动子不同deletion片段共转染后,细胞中相对荧光素酶活性均显著升高,除外SOD2p-7与pcDNA3-NONO-HA共转染组。这一结果说明,过表达的NONO蛋白均可以增强SOD2启动子不同deletion片段的转录活性,除外-154～+48bp这段启动子(-154～+48bp这段启动子几乎没有转录活性),提示我们NONO可能在SOD2基因-354～-154bp区域内发挥转录调控作用。　　 (六)分别使用p38MAPK、JNK、ERK磷酸化通路抑制剂处理RAW264.7细胞后,从蛋白水平检测LPS刺激下NONO对SOD2表达水平的影响。　　 为了探讨LPS刺激下NONO促使SOD2表达水平增高的分子机制,我们设计了以下实验。实验分组:实验分为5组:①转染pcDNA3-NONO—HA组；②转染pcDNA3-NONO-HA及p38 MAP kinase抑制剂SB203580处理组；③转染pcDNA3-NONO-HA及JNK(c-Jun N-terminal kinase)抑制剂SP600125处理组；④转染pcDNA3-NONO—HA及ERK(MAP kinase)抑制剂PD98059处理组；⑤转染pcDNA3-NONO-HA及DMSO处理组。转染后24h,撤FBS6h,之后用各磷酸化通路抑制剂及DMSO预处理细胞1h,以终浓度为1μg/ml向培养基内加入LPS,刺激12h。收细胞,裂解后获取总蛋白,用Western-Blot技术检测各处理组SOD2表达水平。结果显示,与①、⑤对照组相比,用p38 MAP kinase抑制剂SB203580处理细胞后,LPS诱发的NONO介导的SOD2高表达现象很大程度上被该抑制剂所消除,而JNK(c—Jun N-terminal kinase)抑制剂SP600125、ERK(MAP kinase)抑制剂PD98059对NONO介导的LPS诱发的SOD2高表达几乎无影响,与对照组SOD2表达量相似。这一结果提示我们LPS诱导的NONO介导的SOD2高表达可能与p38MAPK磷酸化通路有关,鉴于NONO蛋白是一种多磷酸化蛋白,它是否受p38MAPK磷酸化需要进一步验证。　　 通过以上研究,我们可以得出以下结论:　　 1.NONO可以增强SOD2启动子活性；　　 2.NONO可以上调LPS诱导的SOD2表达水平；　　 3.NONO可能与SOD2启动子-354～-154bp区域相互作用,参与SOD2的转录调控。此结论有待于EMSA和CHIP进一步验证；　　 4.LPS刺激下,NONO使SOD2表达水平增高,与p38MAPK磷酸化通路磷酸化某些蛋白质有关。被磷酸化的蛋白是否是NONO需要进一步验证。　　 本研究证明NONO作为一种新发现的转录因子,可以增强SOD2启动子的活性,进一步增强LPS诱导的SOD2表达水平；并初步确定了NONO在SOD2启动子上的大致结合范围及LPS刺激下,NONO促使SOD2高表达的分子机制,从而为内毒素血症提供了分子靶向治疗的新方法。