论文部分内容阅读
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)具有多种重要的生物学功能,动、植物中的PUFAs以18碳链长以下的脂肪酸为主,而20碳链长以上的脂肪酸可由某些产油微生物提供。高山被孢霉(Mortierella alpina)是一种脂质含量可达自身干重50%以上的产油丝状真菌,能合成多种高附加值的PUFAs,目前已经是工业化生产花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)的主要菌株。二酰甘油酰基转移酶是三酰甘油(Triacylglycerol,TAG)合成途径中的关键限速酶,在不同物种中对其进行遗传改造发现其能显著影响TAG含量和组成。因为高山被孢霉中脂肪酸主要以TAG形式积累且AA含量高达总脂肪酸的30%~40%,其二酰甘油酰基转移酶可能在这方面起到重要作用。本课题以高山被孢霉中二酰甘油酰基转移酶为研究对象,筛选高山被孢霉中的二酰甘油酰基转移酶编码基因,在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中异源表达进行功能鉴定,将能增强脂质积累的基因在高山被孢霉中进行过表达,探索其对高山被孢霉脂质积累的影响,为提高单细胞油脂产量和质量提供理论基础。本文主要研究结果如下:1、通过基因同源性比对分析发现高山被孢霉中含有3种二酰甘油酰基转移酶,分别为3个酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶1(DGAT1;命名MaDGAT1A、MaDGAT1B、MaDGAT1C)、2个酰基辅酶A:二酰甘油酰基转移酶2(DGAT2;命名MaDGAT2A、MaDGAT2B)和1个磷脂:二酰甘油酰基转移酶(PDAT;命名MaPDAT)。对应6个候选编码基因(Madgat1a、Madgat1b、Madgat1c、Madgat2a、Madgat2b、Mapdat)。2、成功构建在酿酒酵母中分别异源表达Madgat1a、Madgat1b、Madgat1c、Madgat2a、Madgat2b、Mapdat的重组菌,且目的蛋白能正确表达。通过薄层色谱与气相-质谱联用法测定酿酒酵母重组菌中TAG和脂质的脂肪酸组成及含量,发现异源表达MaDGAT1A、MaDGAT1B、MaDGAT2A的酿酒酵母中TAG的含量分别提高7.23、12.09、4.91倍,对应总脂质含量提高了2.37、1.94、1.65倍,而MaDGAT2B、MaDGAT1C和MaPDAT则无显著效果,表明高山被孢霉来源的DGAT类二酰甘油酰基转移酶在提高脂质积累方面有显著作用。3、分析在提高脂质积累方面有显著作用的MaDGAT1A/1B/2A/2B对PUFAs的选择性。通过外加不同浓度(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L)的AA,发现MaDGAT1类型和MaDGAT2类型均能提高重组菌对AA的催化效率,且MaDGAT1类型作用效果更显著。同时发现外加不同浓度的AA会影响各酿酒酵母重组菌中TAG的积累。另一方面,通过外源添加亚油酸(Linoleic acid,LA,C18:2)和花生四烯酸(AA,C20:4),探究MaDGAT1A/1B/2A/2B对不同链长PUFAs底物的选择性,发现同时添加C18:2和C20:4可更明显地促进对应蛋白质的催化活性。与对照组相比,异源表达MaDGAT1A/1B/2A/2B对C20:4的催化效率提高倍数均大于对C18:2的,推测高山被孢霉来源的DGAT类二酰甘油酰基转移酶对20碳链长PUFAs的偏好性强于18碳链长PUFAs。4、在高山被孢霉中过表达对提高脂质积累有显著作用的MaDGAT1A/1B/2A/2B,研究结果表明,与对照菌株相比,过表达MaDGAT1B的重组菌可促进高山被孢霉脂质积累,最多使脂质积累量提高18.43%。过表达MaDGAT2A/2B的重组菌能显著提升PUFAs中AA和LA的成分含量,最多使AA和LA含量分别提高22.32%、20.40%,以上结果说明MaDGAT1和MaDGAT2对高山被孢霉脂质和某些特定PUFAs的积累均有一定的促进作用。