线粒体是真核细胞中具有双层膜结构的半自主细胞器,参与生物能量代谢、生物合成和多种类型的信号转导,亦在应激反应中参与细胞适应性调节;同时,也参与细胞分化、代谢物转运和细胞凋亡等过程。大多数与代谢相关的酶蛋白位于线粒体基质,而线粒体膜上的载体蛋白在代谢产物穿梭细胞基质与线粒体内的反应中发挥重要作用。线粒体外膜对丙酮酸等小分子具有很高的通透性,因此丙酮酸可通过自由扩散方式进入线粒体膜间隙,然而线粒体内膜仅对二氧化碳和氧气等小分子通透,其它分子均需要相应的分子载体进出线粒体基质。丙酮酸需由特殊载体转运进出线粒体基质,参与葡萄糖、脂肪和氨基酸代谢。2012年,由Bricker和Herzig等人共同揭示,在哺乳动物中,线粒体内膜上转运丙酮酸的载体蛋白主要由线粒体丙酮酸载体1(mitochondrial pyruvate carrier 1,MPC1)和线粒体丙酮酸载体2(mitochondrial pyruvate carrier 2,MPC2)组成。在酵母中,另外还有着与MPC2高度序列同源性和功能相似性的MPC3基因存在。目前对临床病人的报道中均为MPC1突变的患者,说明MPC1突变在人群中的发生率较高。研究证明,一些线粒体膜载体功能障碍,如线粒体ADP/ATP载体和氨基酸载体等,与炎症或癌症的发生存在一定相关性;针对调控细胞内环境中丙酮酸代谢的治疗方法已用于对帕金森和阿尔梅茨海默症患者,说明丙酮酸代谢相关基因的研究具有一定重要性。鉴于上述观点,我们首先利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建获得MPC1基因敲除小鼠,研究体内MPC1基因缺失对生育能力、体重和糖/胰岛素耐受等基本功能及糖/脂质代谢相关基因的影响;随后,我们利用免疫细胞化学方法检测不同前列腺癌细胞系和食管癌细胞系中MPC1和MPC2表达情况,并利用免疫组织化学方法检测前列腺腺癌和食管鳞状细胞癌组织中MPC1和MPC2蛋白的表达情况,分析该蛋白表达与临床病理学参数及预后的相关关系;进而,我们对MPC基因在肿瘤细胞中的作用做了深入的研究,利用基因编辑技术获得MPC1基因敲除的前列腺癌RM-1细胞系和食管癌KYSE450细胞系,探索MPC1基因缺失对肿瘤细胞的能量代谢和干性程度等因素的影响;最后,根据肿瘤细胞对营养物质依赖性不同,通过改变肿瘤细胞培养环境,了解MPC1基因缺失与上皮-间质形态转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)发生和肿瘤恶变的相关关系。第一部分:线粒体丙酮酸载体基因敲除小鼠模型构建及基本功能分析研究方法1.CRISPR/Cas9质粒构建和SSA方法进行质粒活性鉴定,利用CRISPR介导的基因编辑技术对受精卵基因组编辑,获得MPC1基因敲除子代小鼠;2.对于稳定传代的MPC1基因敲除小鼠,检测其基本生活习性、体重及生育能力变化;3.利用DNA测序,验证CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因组编辑中脱靶效应;4.qRT-PCR检测MPC1基因敲除后糖异生和脂质代谢等相关基因表达的变化,腹腔糖或胰岛素注射检测MPC1基因缺失小鼠糖和胰岛素的耐受性。研究结果1.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,成功获得稳定传代的MPC1杂合敲除小鼠模型,测序和蛋白表达证明MPC1缺失;2.MPC1基因敲除杂合子小鼠无明显的发育缺陷,与野生型小鼠相比,毛色或运动耐力等表型无明显差异。长期交配繁殖过程中,仅获得5只MPC1纯合敲除小鼠,该小鼠无生育能力且在6个月内死亡。MPC1杂合敲除小鼠生育能力低于野生型小鼠。雌性MPC1杂合敲除小鼠在10周龄后比野生型的体重显著增高;3.对MPCl-gl和MPCl-g2质粒脱靶位点在F0代小鼠中发生的可能性进行验证。对于脱靶位点 chr12:+/78920516和chr12:+/8920523,9只小鼠DNA发生碱基缺失/突变。对于脱靶位点chrl2:-112097058和chr12:-112097051,4只小鼠DNA发生多碱基突变。对于chrX +140020779的脱靶可能性检测,小鼠DNA无突变。长期保种获得的NO.1和NO.17小鼠均未发现脱靶位点的突变,而其它具有脱靶位点突变的MPC1杂合敲除小鼠却未能得以保种;4.MPC1基因杂合突变导致葡萄糖和脂肪代谢基因的变化。MPC1基因敲除杂合子小鼠葡萄糖耐受能力降低;在胰岛素耐量试验研究中,MPC1基因敲除杂合子小鼠与野生型小鼠的葡萄糖水平没有明显变化;然而,MPC1杂合缺失小鼠的空腹葡萄糖利用率降低。第二部分:线粒体丙酮酸载体1和2在前列腺癌和食管癌组织中的表达及预后分析研究方法1.利用蛋白印迹和免疫细胞化学方法,验证前列腺癌和食管/食管癌不同细胞系中MPC1和MPC2蛋白表达;2.利用免疫组化方法,检测88例前列腺腺癌组织标本中MPC1和MPC2蛋白的表达,分析MPC1和MPC2蛋白表达与前列腺癌临床病理学参数和患者生存期之间的关系;3.利用免疫组化方法,检测138例食管鳞癌组织标本中MPC1和MPC2蛋白的表达,分析MPC1和MPC2蛋白表达与食管癌临床病理学参数和患者生存期之间的关系;4.应用SPSS 17.0软件进行统计学分析。利用Chi-square或Fisher’s精确检验方法分析MPC1和MPC2蛋白表达和临床变量间的相关关系;利用线性回归方法分析MPC1与MPC2蛋白表达相关性;Kaplan-Meier曲线评价患者生存期,log-rank检验比较组间差异;COX回归用于检测各指标对预后的影响。研究结果1.不同细胞系中MPC1和MPC2蛋白表达检测结果显示,DU145细胞系中MPC1和MPC2表达量均较低,而LNCaP细胞系中MPC1和MPC2表达量均较高。而相对于食管癌细胞系(KYSE70和KYSE450),永生化食管黏膜上皮细胞系HetlA中MPC1和MPC2表达量均较高,分化程度差的KYSE70细胞系中MPC1和MPC2蛋白表达量比KYSE450细胞系表达量明显降低;2.前列腺腺癌组织标本中,大部分癌组织MPC1或MPC2低表达,甚至阴性表达。88例标本中,仅29例(32.95%)组织中MPC1蛋白呈阳性表达,23例(26.14%)组织中MPC2蛋白呈阳性表达。MPC1蛋白的表达与UICC分期(p=0.031)呈负相关,MPC2蛋白的表达与UICC分期(p=0.000)和淋巴结转移(p=0.002)均呈负相关。线性回归分析得出前列腺癌组织样本中MPC1和MPC2蛋白表达成正相关(r=0.375,p=0.006)。MPC1和MPC2蛋白低表达的前列腺腺癌患者总体生存率明显降低(分别为p=0.007和p=0.02);3.138例食管鳞状细胞癌组织标本中,仅36例(26.09%)组织中MPC1蛋白呈阳性表达,33例(23.91%)组织中MPC2蛋白呈阳性表达。MPC1蛋白的表达与临床分期(p=0.038)和淋巴结转移(p=0.024)呈负相关,MPC2蛋白的表达与肿瘤浸润深度(p=0.046)、临床分期(p=0.016)和远处转移(p=0.034)均呈负相关。线性回归分析得出食管癌组织样本中MPC1和MPC2蛋白表达成正相关(r=0.569,p=0.000)。MPC1和MPC2蛋白低表达的食管鳞癌患者总体生存率明显降低(分别为p=0.002和p=0.01);4.多变量检验分析结果显示,在前列腺癌组织标本中,MPC1和MPC2均可以独立作为前列腺腺癌患者总生存率的预测因子(MPC1:RR=0.654,95%CI:0.621-0690,p<0.001;MPC2:RR= 0.696,95%CI:0.660-0.734,p<0.001);在食管癌组织标本中,仅 MPC2(RR=0.655,95%CI:0.439-0.978,p=0.039)可以独立作为食管鳞癌患者总生存率的预测因子。第三部分:线粒体丙酮酸载体功能与肿瘤细胞干性和代谢重编程作用的研究研究方法1.利用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对前列腺癌细胞系RM-1和食管癌细胞系KYSE450进行MPC1基因敲除,挑选单克隆,建立稳定的MPC1基因敲除细胞系;2.利用细胞免疫化学、免疫荧光和蛋白印迹验证MPC1基因敲除细胞蛋白表达。通过检测丙酮酸、乳酸、葡萄糖和ATP的变化,以及应用Seahorse XFe96检测细胞内氧化磷酸化偶联的细胞氧耗和胞外酸化速率,分析敲除MPC1基因后肿瘤细胞丙酮酸转运、糖酵解和氧化磷酸化代谢模式的变化;3.MTT检测细胞生长,流式检测周期,了解增殖能力;划痕和Transwell assay实验了解细胞迁移侵袭能力,流式检测胞内总ROS含量,克隆形成实验了解细胞化/放疗敏感性,蛋白印迹方法和流式分析干细胞标记蛋白Notchl、Hiflα、Nanog、ALDH 和 CD44 表达的改变。研究结果1.成功构建MPC1基因稳定敲除RM-1和KYSE450细胞系模型,分别为RM-1 MPC1-/-和 KYSE450 MPCIKO 细胞;2.MPC1基因敲除后,肿瘤细胞表现为丙酮酸代谢障碍、葡萄糖消耗和乳酸产量增多,氧化呼吸能力和ATP产量降低,细胞处于氧化磷酸化抑制和糖酵解增强的代谢模式;3.MPC1基因敲除后,肿瘤细胞增殖减缓、周期抑制,ROS产量增高而清除能力降低,侵袭/转移能力增强,细胞产生化/放疗抵抗,干细胞相关蛋白Notch1、Hif1α、Nanog、ALDH和CD44表达升高,提示MPC1基因敲除后的肿瘤细胞干性特征增强。第四部分:肿瘤细胞线粒体丙酮酸载体功能障碍与谷氨酰胺剥夺培养的研究研究方法1.谷氨酰胺剥夺培养后,对细胞形态变化进行动态监测,IncuCyte ZOOMTM监测细胞生长,流式细胞术检测周期;2.细胞谷氨酰胺消耗量检测,代谢组学检测细胞代谢补偿途径激活;3.谷氨酰胺剥夺培养下,F-actin验证细胞发生EMT、蛋白印迹检测EMT相关蛋白表达以及Transwell验证细胞侵袭转移能力;4.检测MPC1基因缺失细胞葡萄糖消耗、ATP产生和氧化呼吸能力改变,分析MPC1基因与谷氨酰胺剥夺培养对细胞的恶性程度的影响;不同培养情况下,转录组学检测差异性基因及差异基因相关GO和KEGG通路变化。研究结果1.MPC1基因敲除细胞对谷氨酰胺的依赖性增强。谷氨酰胺剥夺培养情况下,细胞增殖速率显著减缓,生长周期抑制。不同细胞对谷氨酰胺剥夺的反应不一致,KYSE450和KYSE450 MPC1KO细胞仅出现细胞生长减缓,而RM-1细胞生长减缓,RM-1 MPC1-/-细胞由小圆形变为长梭形;2.RM-1MPC1-/-细胞较RM-1细胞的谷氨酰胺消耗速率显著升高,胞内代谢产物发生显著变化。利用L-丙氨酸氨基转移酶的竞争性抑制剂β-氯-L-丙氨酸处理细胞,细胞出现生长速度减缓和凋亡率增高;3.长期谷氨酰胺剥夺培养条件下,RM-1MPC1-/-细胞形态呈EMT变化,EMT相关蛋白表达变化显著,细胞侵袭转移能力增强;4.谷氨酰胺剥夺培养,使RM-1MPC1-/-细胞糖耗速率进一步提高,迫使细胞更倾向于糖酵解产生能量,ATP产量显著降低。转录组学证明,谷氨酰胺剥夺培养,细胞内信号通路发生变化。研究结论1.CRISPR/Cas9系统对胚胎基因组编辑可获得的MPC1敲除小鼠,说明该系统在小鼠中的基因编辑效率高。对MPC1基因敲除小鼠模型的研究证明,MPC1对生长状况和发育并无影响,但小鼠的生育能力显著降低,并出现体重、葡萄糖/胰岛素耐受变化,提示对具有相应临床表现的人群进行MPC1杂合缺失的检测有重要意义;2.MPC1/2蛋白在前列腺腺癌和食管鳞状细胞癌组织中的表达降低,MPC1/2蛋白阴性/弱阳性表达提示临床预后差,说明糖代谢相关基因的表达在前列腺和食管癌的发生发展中起着重要的作用;3.MPC1基因敲除细胞出现丙酮酸转运障碍,氧化磷酸化抑制和糖酵解代谢模式增强,说明MPC1基因敲除细胞具有瓦伯格效应特征;同时MPC1基因敲除前列腺癌和食管癌细胞周期抑制、侵袭转移能力增强,干性相关蛋白表达增加,提示MPC1基因表达可用作评价肿瘤恶性程度;4.通过敲除MPC1基因阻断正常三羧酸循环后,细胞代谢补偿通路活化,谷氨酰胺依赖性增强。谷氨酰胺剥夺培养,细胞处于极度恶劣环境下,出现EMT变化,恶性程度增强,提示肿瘤代谢微环境的研究对于肿瘤发生、发展的机制和探索肿瘤治疗有重要的意义。