抗生素不仅可以预防病原菌感染造成的畜禽疾病,还可作为生长促进剂添加在饲料当中以促进畜禽生长。在奶牛养殖过程中,抗生素被广泛应用于治疗奶牛乳腺炎。但由于长期不规范、不合理地使用抗生素,导致了家畜源抗生素抗性菌株频发,其中金黄色葡萄球菌作为奶牛乳腺炎的主要致病菌,给奶牛健康养殖与乳产业的可持续发展造成了极大的威胁。针对奶牛乳腺炎进行抗生素治疗的过程中发现原本不耐药的金黄色葡萄球菌会逐渐进化出对抗生素的耐受性,该过程被认为是细菌产生耐药性的基础,并且耐受菌株可在高浓度的抗生素治疗过程中存活更久,这将导致病原菌难以被根除,从而导致疾病的反复发作。目前针对革兰氏阴性菌的耐受机制已有多项研究报道,而革兰氏阳性菌耐受机制的相关研究较少。时至今日,万古霉素仍被用于治疗严重的革兰氏阳性菌感染,因此,阐明金黄色葡萄球菌的万古霉素耐受机制对于合理用药及新型抗菌药物开发具有极大的参考价值,且对奶牛乳腺炎的防治及乳业健康发展至关重要。本试验前期构建了抗生素体外诱导模型,以金黄色葡萄球菌Newman为模式菌株,将其反复暴露在高浓度万古霉素（20×MIC）环境下进行诱导,对分离出的VTSA菌株进行测序并确定其中具有重要功能的关键基因,并测得了VTSA菌株的相关表型。主要研究结果如下:1、通过抗生素体外诱导试验成功诱导并分离出101株对万古霉素具有耐受性的金黄色葡萄球菌菌株,对其中9株VTSA进行全基因组测序鉴定,并依据全基因组测序结果对所有101株菌进行Sanger测序鉴定。根据测序结果将其分为14种（G0～G13）不同的基因型,其中,G0:8-17SC1菌株在编码序列未产生非同义突变。在所有18个基因的19种非同义突变中,pbp4、mut L、stp1、htr A和pth基因的突变频率较高。2、为进一步探究突变基因在金黄色葡萄球菌万古霉素耐受性形成过程中的关键基因,采用质粒回补的方式对所有突变基因单独进行回补,并使用万古霉素杀伤试验对菌株的抗生素耐受性进行了检测。其中,向VTSA菌株中回补NWMN＿1068、pbp4、stp1、pth和htr A基因后菌株恢复其对万古霉素的敏感性,表明这些基因产生的突变对VTSA菌株耐受表型的获得具有重要作用。mut L基因突变导致菌株自发突变率显著提高,表明其突变基因快速积累,从而加快了金黄色葡萄球菌在抗生素压力环境下耐受表型的形成。在G0:8-17SC1菌株中进行的研究表明,非编码区产生的突变对金黄色葡萄球菌万古霉素耐受性的形成同样不容忽视。3、对VTSA的细胞壁、生长能力与生物被膜形成能力等表型进行了检测。试验数据显示,溶葡球菌酶对VTSA菌株裂解能力下降,Triton X-100诱导VTSA自溶能力下降。透射电镜数据与其统计结果显示,与野生型菌株相比,VTSA菌株细胞壁厚度普遍增加。这些现象共同表明,VTSA菌株细胞壁相关表型发生了一系列变化,包括:自溶能力下降、溶葡球菌酶敏感性降低和细胞壁增厚。VTSA菌株交叉耐受试验结果表明,VTSA菌株获得了对其它以细胞壁合成为靶点的抗生素的交叉耐受能力。除此之外,pth基因突变不仅使金黄色葡萄球菌获得了对3种抗生素的耐受性,还增强了菌株生物被膜形成的能力。综上所述,本研究利用体外诱导体系筛选并分离出VTSA菌株,通过测序分析其遗传背景,并与体外抗生素杀伤试验相结合,发现了6个在金黄色葡萄球菌耐受性形成过程中起关键作用的基因,并对VTSA菌株的相关表型进行了进一步测定,发现其对多种抗生素交叉耐受的特性。这些研究结果对于临床耐万古霉素分离株的检测和预防抗生素耐药性的发展具有重要意义,为新型抗菌药物开发提供了理论基础,为奶牛健康养殖提供了新的思路。