自养硝化细菌的分离、鉴定及norB基因工程菌的构建

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自养型硝化细菌是参与生物脱氮过程中起硝化作用的主要菌群,其硝化速率直接影响污水处理系统的硝化效果和生物脱氮效率,是污水生物脱氮的限制性因素。本研究通过富集、分离纯化的方式筛选自养硝化细菌,采用传统微生物学方法和现代分子生物学手段对其鉴定,找到起硝化作用的norB基因,利用基因工程的手段构建高效硝化工程菌,旨在改变自养硝化细菌生长周期长,脱氮效率低的缺点。自养硝化细菌的分离、鉴定及系统发育分析:以城市污水处理厂A2/O工艺中好氧活性污泥为菌源,筛选出两株自养型硝化细菌N3和N4。转接两株菌至液体分离培养基中培养14天,经检测,两株菌的硝化效果均可达100%。通过形态观察、生理生化实验初步鉴定表明,两株菌属于硝化杆菌属。利用分子生物学手段:DNA提取、PCR扩增、克隆、测序对菌株进一步鉴定,测序结果提交Genbank进行同源性检索,并通过MEGA软件进行比对和系统发育分析。16S rDNA序列分析表明这两株菌均属于硝化杆菌属,与维氏硝化细菌的同源性高达98%。norB还原酶基因工程菌的构建:以N3为出发菌株,N3的基因组DNA为模板,根据N3的硝化还原酶norB操纵基因序列和质粒载体pET-28a的多克隆位点设计引物,PCR扩增得到norB基因。之后,经过EcoRI、HindsⅢ双酶切,定向克隆到pET-28a载体上,化学转化至DH5a克隆菌感受态中,构建含有重组质粒的转化子pET-28a-norB。经酶切和测序鉴定,扩增产物的碱基序列与N3中norB操纵基因序列完全吻合。将重组质粒pET-28a-norB转化表达菌株BL21中,构建硝化基因工程菌pET-28a-norB-BL21(PNB)。采用用SDS-PAGE电泳验证norB还原酶在PNB是否成功表达,得到一条57KDa大小的蛋白条带,与预期大小一致。对重组基因工程菌PNB进行硝化效果测定,结果表明菌株PNB比菌株N3的硝化速率高12.7%。
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