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目的:病毒性心肌炎(Viral myocarditis,VMC)是一种潜在的严重威胁生命的心血管感染性疾病,会导致心律不齐、心脏扩张,严重者可致心力衰竭甚至死亡,这也是成为青少年猝死的主要原因之一。研究表明,病毒对心肌细胞的直接病变效应和过强的免疫反应对心肌细胞产生的间接损伤是病毒性心肌炎的主要致病途径,但是更全面、具体的致病机理和发病过程并不十分明确。miRNA是一类内源性非编码小RNA,它通过碱基互补配对与靶点mRNA的3’端非编码区结合,从而抑制蛋白的翻译,最终参与多种疾病的发生发展过程。已有大量研究发现,miRNA与病毒性心肌炎的发病机制存在密切相关性,如miRNA-203通过调节锌指蛋白-148的表达增强柯萨奇病毒B3的复制能力;miRNA-381通过调节环氧合酶-2提高心肌细胞的功能。作用于RNA的腺苷脱氨酶(Adenosine deaminases acting on RNA,ADAR)是最近发现的一类能修饰miRNA的内源性编辑酶,一方面能够对miRNA的前体重新编码,阻断其成熟过程;另一方面可以与Dicer酶结合加速miRNA的成熟过程以及参与基因沉默复合体的形成。据此,本实验以BALB/C小鼠和心肌细胞为研究对象,探索ADAR1是否在病毒性心肌炎中参与调节miRNA的生成过程,从而在发病机制中发挥作用,最终为临床治疗和法医病理鉴定提供理论依据。方法:本研究采用小鼠腹腔微量注射柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3,CVB3)的方式进行病毒性心肌炎造模,通过组织病理学确定模型建立成功。免疫印迹法(Western blot,WB)检测ADAR1 在病毒性心肌炎中的表达量,免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,CO-IP)检测 ADAR1 与 Dicer 酶形成复合物。RT-qPCR 检测病毒性心肌炎中miRNA-222的表达量,通过预测分析软件targetscan和查阅相关文献预测 miRNA-222 下游靶蛋白 PTEN(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN),通过 miRNA mimics 和 miRNA inhibitor 上调和下调miRNA-222后,WB检测下游靶蛋白PTEN的表达。在心肌细胞中,通过质粒和siRNA的转染,上调和下调ADAR1p150的表达后,采用RT-qPCR和WB分别检测miRNA-222和PTEN的表达量。最后,以细胞计数方式(Cell counting kit,CCK-8)检测细胞被敲除ADAR1p150的活力。结果:(1)建立病毒性心肌炎模型HE切片染色显示:小鼠心脏在感染病毒7天后心肌纤维出现波浪样变,心肌间质开始出现以中性粒细胞为主的炎细胞浸润,肌纤维断裂。(2)ADAR1在病毒性心肌炎中的表达小鼠感染CVB3后,心脏组织中ADAR1p150表达量较对照组明显升高,有统计学意义,而亚型ADAR1p110表达量与对照组相比无差异,结果无统计学意义。为进一步验证此结果,通过体外细胞培养实验检测SD大鼠原代心肌细胞(Neonatal rat cardiomyocytes,NRVM)、大鼠原代心肌成纤维细胞(Primary rat fibroblasts,CF)和H9c2细胞系感染CVB3后ADAR1的表达情况,其趋势和动物模型一致。(3)ADAR1p150和Dicer酶形成复合物通过免疫共沉淀分析发现,ADAR1p150和Dicer酶形成复合物并发生蛋白间直接相互作用。(4)miRNA-222在病毒性心肌炎中的表达及其调控作用RT-qPCR检测结果显示:小鼠感染病毒后,心肌组织中miRNA-222相对表达量较对照组明显升高,而miRNA(miRNA-221,17,151,432)的相对表达量无差异性改变,无统计学意义。在NRVM和CF感染病毒后,miRNA-222的表达变化趋势和动物一致。Target scan预测分析发现PTEN为miRNA-222的作用靶点,在心肌细胞中,通过miRNA mimics和miRNA inhibitor上调和下调miRNA-222后,结果显示PTEN的表达量随miRNA-222的上调而降低;反之,升高。(5)ADAR1p150 调节 miRNA-222 和 PTEN 的表达在SD大鼠原代心肌细胞中,上调和下调ADAR1p150后,检测miRNA-222和PTEN的表达量,结果显示两者都有明显改变:上调ADAR1p150后,miRNA-222表达量增加,PTEN表达量下降;下调ADAR1p150后,miRNA-222表达量下降,PTEN表达量升高。为进一步明确此调控关系,在H9c2感染病毒后,抑制miRNA-222的表达,检测PTEN的表达,结果发现PTEN表达下调后有回升趋势。(6)内源性ADAR1p150对心肌细胞活力以及凋亡相关蛋白的影响SD大鼠原代心肌细胞中的ADAR1p150表达被抑制后,用微量病毒(常规剂量的1/2,5倍的感染复数)感染心肌细胞,24h和48h后CCK-8检测细胞活力,结果发现:ADAR1p150表达被抑制的细胞活力较对照组明显下降。通过WB检测凋亡相关蛋白的变化,发现Bc12的表达较对照组减少,而Bax的表达较对照组增加,提示实验组细胞凋亡增加,据此推断ADAR1p150可以对心肌细胞产生抗凋亡保护作用。结论:(1)在CVB3诱导的病毒性心肌炎中,ADAR1p150表达升高。(2)ADAR1p150和Dicer蛋白形成复合物并发生调节miRNA-222/PTEN的作用。(3)在病毒性心肌炎中,ADAR1p150通过调节miRNA-222/PTEN的表达对心肌细胞产生抗凋亡作用。