研究背景糖尿病主要表现高血糖症和血管的进行性损伤,并伴随着心血管疾病的发生,已成为全球性的主要健康问题。高血压是导致心血管疾病最常见的危险因子,糖尿病患者高血压发病率高于正常人群,增加对高血压危险因素的敏感性。并且,糖尿病合并高血压患者与单纯高血压患者或单纯的糖尿病患者相比,其心血管并发症风险和血管进行性损伤显著增加。因此阐明糖尿病状态下对高血压易感性增加的机制是降低糖尿病患者高血压发病率及死亡率的关键。高盐饮食是高血压危险因素中最常见的一种。流行病学研究已明确高盐饮食会导致血压升高并增加日后患心脏病和中风的风险,但其机制仍不清楚。高盐饮食促进血管收缩可能与增加血管收缩因子内皮收缩因子-1的核表达,钠/钙交换机制的增强,活性氧簇ROS的增加,一氧化氮(NO)活性的减低有关。自发性高血压大鼠的胰岛素诱导的NO舒张能力及Akt/内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,e NOS)活性下降。高盐对糖尿病患者的血压同样起着重要的作用。但是高盐饮食导致的内皮功能损害,使糖尿病患者更易伴发高血压的机制仍不清楚。窖蛋白(caveolin)/脂质筏是膜特殊的微结构,是多分子信号传递的区域。细胞内多种信号分子是通过与窖蛋白Cav-1(caveolin-1,Cav-1)的相互作用完成信号转导过程。Cav-1在很多细胞上都有表达,如内皮细胞,平滑肌细胞,脂肪细胞和纤维母细胞。有研究提示,Cav-1是连接胰岛素抵抗和高血压发病之间重要的信号分子[1]。有研究发现Cav-1与e NOS共同锚定在窖蛋白,限定了e NOS的转位、磷酸化,维持e NOS未被激活的状态。也有实验显示糖尿病患者的Cav-1表达增加。但是e NOS和Cav-1之间的相互作用在糖尿病内皮功能障碍中的作用仍不清楚。本研究将从Cav-1和e NOS之间的相互作用探讨糖尿病状态下高盐饮食引发高血压的易感性及其信号机制,期望为临床更有效治疗糖尿病罹患高血压患者提供新的实验依据。实验目的1.研究糖尿病状态下给予高盐饮食是否加重血管功能障碍;2.若是,进一步研究血管损害的分子机制,主要探讨Cav-1在其中的作用。实验方法1.糖尿病大鼠模型制备及实验分组:SD大鼠(150 g-180 g)120只,腹腔注射链唑霉素(STZ,70 mg·kg-1),3天后空腹血糖≥16.7 m M为1型糖尿病大鼠(DM)。正常大鼠和糖尿病大鼠分别给予正常饮食(CON)和高盐饮食(HS,8%Na Cl)6周(HS,DM+HS)。每周测血压和空腹血糖。2.分别于3周,6周离体观察外周阻力血管收缩舒张功能。肠系膜三级动脉剪成1 mm长的血管环,用苯肾上腺素(PE,1μM),产生约13.2-20.0 m N预收缩。ACh(10-10-10-6mol/L),胰岛素(10-10-10-6 mol/L),SNP(10-8-10-4 mol/L)观察血管的舒张功能。检测血浆中的NOx浓度,血管ROS的水平。3.HE染色观察肠系膜动脉的结构变化。4.免疫荧光双染检测主动脉e NOS、Cav-1的表达和分布。为明确Cav-1和e NOS的关系,免疫共沉淀观察肠系膜动脉两者的相互关系。5.采用免疫印迹技术检测Akt、e NOS和Cav-1的表达水平。6.HUVEC培养给予wortmannin、L-NAME及Cav-1 si RNA,免疫印迹技术检测观察Cav-1与eNOS之间的关系。实验结果1.与对照组相比,HS组高盐饮食收缩压逐渐升高,至6周时收缩压达143±10 mm Hg。证实高盐饮食确可诱导发生高血压。与对照组相比,单纯DM组3周和6周的收缩压与正常组无显著区别。但是,在DM+HS组,高盐饮食1周后即出现收缩压和舒张压升高,3周后收缩压达151±11 mm Hg,至6周时收缩压达169±11 mm Hg,明显高于HS组(P<0.01)。该结果表明在糖尿病状态下HS诱发血压升高的时间显著缩短。2.离体观察外周阻力血管舒张功能结果显示:与对照组相比,单独DM组和单独HS组3周时ACh和胰岛素引起的内皮依赖性舒张作用开始出现降低(P<0.01),但SNP的血管舒张作用未见明显下降。DM+HS组ACh和胰岛素引起的内皮依赖性舒张作用明显低于其他组(P<0.01)。6周时,单独DM组(42.0±4.5%,P<0.01)和单独HS组(22.3±4.1%,P<0.05)ACh和胰岛素引起的内皮依赖性舒张作用进一步降低,但SNP的血管舒张作用仍未见明显下降。DM+HS组不但ACh和胰岛素引起的内皮依赖性舒张作用进一步减退(P<0.01),而且SNP的对血管的直接舒张作用也明显降低(P<0.01)。3周DM+HS组血管组织NOx浓度较单独HS显著降低(P<0.01)。至6周时,NO水平进一步减退(P<0.01)。上述结果提示,糖尿病状态下HS导致血管舒张功能障碍的时程显著提前。并且,DM+HS对阻力血管的损伤程度也显著加重。同时发现,6周DM+HS组血管组织的ROS水平显著高于单独DM组和单纯HS组。3.为进一步明确DM+HS促发高血压的损伤程度,采用形态学观察发现,6周后,DM+HS组的血管壁厚度要比单独HS组显著减小(P<0.01)。提示DM+HS组血管损伤显著加重。与上述功能学结果相一致。4.更为重要的是,在单独DM和单独HS和DM+HS组均观察到e NOS和Cav-1共同表达于主动脉内皮细胞,但DM+HS组的e NOS与Cav-1共定位有所增加。DM+HS组中免疫共沉淀结果显示e NOS与Cav-1形成复合物显著增加。5.DM组在3周时,血管组织p-Akt,p-e NOS水平显著降低(P<0.01)。HS组,p-e NOS水平有降低趋势。但DM+HS组p-Akt,p-e NOS水平显著低于单独HS组。3周时DM组血管组织Cav-1水平略有升高,HS组,Cav-1升高较为明显,而DM+HS组的Cav-1显著高于其他各组。结果表明DM+HS可将Cav-1上调时间点显著提前。6周时,单独DM和单独HS组p-e NOS均显著降低,Cav-1均升高。DM+HS组p-Akt,p-e NOS最低,Cav-1表达最高。6.为明确两者关系,在HUVEC实验中,Cav-1 si RNA转染后,Cav-1减少,e NOS表达却显著上升,p-e NOS水平也上升。给予PI3K抑制剂wortmannin和NOS阻断剂L-NAME,e NOS表达均显著下降(P<0.01),而Cav-1表达却无明显下降。该结果提示,是Cav-1表达量的改变,进而增加了e NOS与Cav-1形成复合物,使p-e NOS降低,导致NO减少。结论1.糖尿病合并高盐饮食可进一步加重糖尿病造成的血管损伤及功能障碍。2.糖尿病状态下,血管Akt-e NOS通路活性受损,而高盐饮食可诱导血管Cav-1上调、并与e NOS结合使可供激活的e NOS减少,使NO生成降低,ROS生成增多,从而加重血管舒张功能障碍。