结直肠癌(colorectal cancer,CRC)发病率在世界恶性肿瘤中排名第三位,肝转移是结直肠癌患者死亡的主要原因之一。多种遗传学的改变在结直肠癌的发生发展中起重要作用,最重要的改变包括RAS-R AF/PI3K通路相关基因的体细胞突变和20q染色体扩增。RAS-RAF/PI3K通路相关基因突变不仅提示患者对抗EGFR的靶向药物耐药,而且与临床病理特征、转移和预后密切相关。此外,20号染色体长臂(20q)显著扩增的患者发生肝转移的风险要明显高于其他患者。上述研究数据多数来源于西方患者,仅有几篇文献报道过中国人群中RAS-R AF/PI3K通路中KRAS2号外显子、BRAF和PIK3CA等频率较高的基因突变,关于KRAS 3、4号外显子和NRAS等频率较低的基因突变仅见一篇报道。因此,本研究旨在中国结直肠癌患者中检测RAS-RAF/P13K通路相关基因的主要突变区,包括KRAS外显子2、3、4,NRAS外显子2和3、BRAF以及PIK3CA基因,以明确其突变频率和突变类型的分布。同时设计多个位于20q的BAC探针,结合iFISH技术了解原发灶中20q的扩增状态,并将上述数据结合患者的临床病理特征和随访资料进行综合分析。为中国结直肠癌患者靶向药物的选择及肝转移早期诊断提供重要依据。收集东南大学附属中大医院和东南大学附属江阴市人民医院2007年-2012年共353例结直肠癌患者的原发灶石蜡标本,所有患者均有完整的临床病理及随访资料。提取肿瘤组织基因组DNA,采用PCR-直接测序的方法检测KRAS基因的2、3、4外显子,NRAS2和3外显子,BRAF 15外显子和IK3CA的9、20外显子,综合分析所有突变与患者临床病理、术后远处转移及生存状况之间的关系。获得主要结果如下：1.结直肠癌患者中KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA的突变频率依次为52.7%、3.4%、4.5%和13.1%,其中KRAS2号外显子之外的RAS基因的突变频率可达到14%。2.NRAS突变在女性患者中出现的频率高于男性患者(75% vs 25%,p=0.019)；BRAF突变显示与不良的原发灶病理分级(p=0.003)、高TNM分期(p=0.001)、较深的原发灶浸润程度(p=0.019)相关；同时,BRAF突变的患者发生淋巴结转移(p=0.004)、术前和术后转移(术前转移：p=0.002；术后转移：p=0.016)的风险增高；PIK3CA基因突变频率在结肠癌患者中升高(p=0.014)。3.KRAS2号外显子突变患者的平均年龄高于野生型患者(67岁vs 64岁,p=0.036),此类患者发生淋巴结转移的风险也显著高于后者(52.3% vs 41.6%,p=0.046)。KRAS3号外显子突变与低TNM分期(p=0.011)、较浅的原发灶浸润程度(p=0.001)相关。4.BRAF突变与患者总体生存率降低显示出强相关性(p<0.001),携带PIK3CA和NRAS突变的Ⅰ-Ⅲ期结直肠癌患者发生术后远处转移的风险显著增加(p=0.033；p=0.017),并能分别作为提示患者远处转移的独立指标(PIK3CA:HR=3.129,p=0.003;NRAS:HR=5.152, p=0.003)。本实验室前期已经挑选出40例未转移和6例肝转移的样本,并成功进行iFISH杂交和探针计数。本研究将肝转移患者增加到10例,另增加11例肝外转移的患者。根据我们设计的3个20q染色体的BAC克隆探针,结合iFISH(间期荧光原位杂交)技术直接检测每个标本单个肿瘤细胞中20q的扩增状态。绘制ROC曲线并设定的临界值,根据临界值分组分析20q扩增与患者临床病理特征、生存及肝转移间的相关性。获得主要结果：在肿瘤腺体中,实验探针信号明显多于参照探针,三个实验探针的均值与参照探针之间存在明显的统计学差异(p<0.05)。由于三个实验探针分别杂交20q的上部、中部和尾部,说明结直肠癌中20q扩增的片段可能横跨20q12到20qter的区域,3.20q13.2/20p12探针最适合评价肿瘤腺体20q的扩增情况。由于样本量小,尚未发现20q扩增状态与患者临床病理特征、预后及肝转移间存在统计学相关性。日前我国开始着手准备精准医学计划,并已公布第一批肿瘤诊断与治疗项目高通量基因测序技术的临床应用试点单位,旨在通过基因层面更精确的指导肿瘤治疗和预测生存。我们的研究数据为预测抗EGFR靶向药物的有效性提供了重要依据,我们发现RAS-RAF/PI3K信号通路相关基因的总突变频率高达62.3%,说明可能有过半的患者并不能真正从靶向治疗中获益。当患者在未进行基因检测的情况下使用此类药物,无效的治疗反而使患者忍受极大的毒副反应和承担昂贵的治疗费用。因此应该积极探索肿瘤患者的分子遗传学改变,继续寻找更多、更合适的分子标志物,以期指导靶向药物的选择和对患者转移和预后的评估、监测。