感染性角膜炎是眼科临床常见的致盲性疾病之一,主要的病原微生物有细菌、病毒和真菌等。大部分的细菌性和病毒性角膜炎对抗感染药物的敏感性好,治愈率较高。真菌因其细胞壁厚,抗药性强,真菌性角膜炎的药物治疗效果不明显。对于药物治疗无效的真菌性角膜炎等感染性角膜炎,必须采取角膜移植手术,才可能控制感染,挽救视功能。受到角膜供体来源限制,这类患者往往失去手术时机导致视力严重损害、眼球萎缩甚至眼球摘除。核黄素紫外线角膜交联近年来已成功应用于圆锥角膜的临床治疗。核黄素即维生素B2,是一种人体必需的维生素,在角膜交联的过程中,受一定波长(365nm或370nm)紫外光照射,核黄素吸收能量转变为激发态,产生氧自由基和单态氧,可导致微生物的核酸断裂并阻止核酸复制,这一原理引起有关研究者的兴趣。将核黄素角膜交联应用于真菌性角膜炎等难治性角膜感染疾病,有望达到既可以灭活病原微生物,又可以通过胶原纤维交联增加角膜硬度及减少瘢痕形成。目的本研究采用目前临床通用的标准参数的核黄素紫外线角膜交联方法,探讨核黄素角膜交联在离体条件下对不同浓度的茄病镰刀菌和白色念珠菌的灭活效应,以及其对两种致病菌所致的新西兰大白兔的实验真菌性角膜炎的治疗作用。方法1离体试验：将分离纯化所得的茄病镰刀菌和白色念珠菌,分别用无菌的磷酸盐缓冲液配制菌悬液,根据麦氏浊度仪调整浓度(茄病镰刀菌菌悬液1.0麦氏单位浊度相当于3×108CFU/ml,白色念珠菌菌悬液0.5麦氏单位浊度相当于1.5×108CFU/ML),用无菌的磷酸盐缓冲液稀释10倍配制两种真菌菌悬液原液,以平板菌落计数法确定原液实际浓度。实验分4组：对照组、核黄素组、紫外线组、角膜交联组(核黄素+紫外线)。核黄素组和角膜交联组的菌悬液均由所配原液加入适量PBS溶液和核黄素溶液后倍比稀释所得,使菌悬液浓度等级分别约为106、105、104、103、102CFU/ml,最终核黄素浓度则均为0.1%。对照组、紫外线组的菌悬液不含核黄素,仅由上述原液加入适量PBS倍比稀释,使菌悬液浓度等级分别约为106、105、104、103、102CFU/ml。各组的菌悬液均于每次实验前半小时内配制。角膜交联组和紫外线组的菌悬液在洁净工作台避光进行标准角膜交联参数的紫外线照射,核黄素组和对照组培养板在洁净工作台避光保存(无紫外线照射)。时间均为30min。用平板菌落计数法计算并比较4组：对照组、核黄素组、紫外线组、角膜交联组(核黄素+紫外线)各浓度等级菌悬液的残留菌数(CFU/ml),以及各浓度等级菌悬液的抗菌率2动物模型：经角膜基质注射法制造两种致病菌的真菌性角膜炎的新西兰大白兔模型。茄病镰刀菌组和白色念珠菌组各20只。每只兔随机1眼采用核黄素角膜交联治疗,茄病镰刀菌组对侧眼滴那他霉素滴眼液,白色念珠菌组对侧眼滴酮康唑滴眼液治疗。于治疗前当日和治疗后第1,3,7日裂隙灯显微镜行角膜2%荧光素钠染色检查,测量角膜溃疡的最大直径,观察前房反应等。于第7,14日记录两组的交联眼和药物眼溃疡愈合的眼数。于第14日将两组的交联眼和药物眼未治愈者处死,取中央直径9mm角膜片,立即称重后培养,72小时后菌落计数。另从两组的交联眼和药物眼角膜溃疡均愈合者各2眼处死,摘除眼球,角膜行组织病理学检查。结果1核黄素角膜交联可部分灭活低浓度的茄病镰刀菌和白色念珠菌；在白色念珠菌菌悬液的各稀释浓度中,角膜交联组的残留菌数均低于对照组、核黄素组和紫外线组(P<0.01),对照组、核黄素组和紫外线组的残留菌数比较差异无统计学意义。角膜交联组的抗菌率在浓度等级106、105、104、103、102CFU/ml的菌悬液中,分别为32.2%、33.1%、49.0%、57.8%、62.3%。抗菌率与菌悬液浓度对数转换值之间的线性回归拟合方程为抗菌百分率=82.043-8.452×菌悬液实际浓度(Lg值)(P<0.01)。在茄病镰刀菌菌悬液的104、103、102CFU/ml浓度中,角膜交联组的残留菌数均低于对照组、核黄素组和紫外线组(P<0.01),对照组、核黄素组和紫外线组的残留菌数比较差异无统计学意义。角膜交联组的抗菌率在浓度等级104、103、102CFU/ml的菌悬液中,分别为25.7%、28.2%、45.1%。抗菌率与菌悬液浓度对数转换值之间的线性回归拟合方程为抗菌百分率=66.060-9.567×菌悬液实际浓度(Lg值)(P<0.01)。2茄病镰刀菌组中,交联眼治疗前溃疡直径,治疗后第7日溃疡直径0.41±0.27mm,治疗后与治疗前比较有显著性差异,药物眼治疗前溃疡直径,治疗后第7日溃疡直径0.75±0.32mm,治疗后与治疗前比较有显著性差异；治疗后第7日,交联眼溃疡愈合15眼,药物眼13眼,愈合率差异有统计学意义,治疗后第14日,交联眼溃疡愈合17眼,药物眼13眼,愈合率差异有统计学意义；治疗后第14日,交联眼溃疡未愈合5眼,茄病镰刀菌含量34.74±8.17CFU/g,药物眼溃疡未愈合7眼,茄病镰刀菌含量54.27±7.35CFU/g,差异有统计学意义白色念珠菌组中,交联眼治疗前溃疡直径,治疗后第7日溃疡直径0.18±0.07mm,治疗后与治疗前比较有显著性差异,药物眼治疗前溃疡直径,治疗后第7日溃疡直径0.56±0.22mm,治疗后与治疗前比较有显著性差异；治疗后第7日,交联眼溃疡愈合16眼,药物眼12眼,愈合率差异有统计学意义,治疗后第14日,交联眼溃疡愈合17眼,药物眼14眼,愈合率差异有统计学意义；治疗后第14日,交联眼溃疡未愈合3眼,白色念珠菌含量为28.63±7.79CFU/g,药物眼溃疡未愈合6眼,白色念珠菌含量44.15±6.48CFU/g,差异有统计学意义。两组的交联眼角膜组织切片显示胶原纤维排列整齐紧密,瘢痕组织不明显。结论：1.离体条件下,标准参数的核黄素角膜交联方法对较低浓度的茄病镰刀菌和白色念珠菌有部分灭活效应,抗菌率与菌液浓度对数值负相关。2.标准参数的核黄素角膜交联方法有效治愈兔模型的茄病镰刀菌和白色念珠菌角膜炎,并有利于角膜组织修复。核黄素角膜交联有望成为临床治疗真菌性角膜炎的新方法。