研究背景及目的:恶性淋巴瘤的发病率逐年增高,已经成为严重威胁人类健康和生命的主要肿瘤之一。NK/T细胞淋巴瘤(NK/T cell lymphoma,NKTCL)作为侵袭性非霍奇金淋巴瘤的一种独特类型,生存期短、预后差。EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染在NKTCL的发生发展过程中发挥关键作用,其基因组编码的癌蛋白LMP-1、microRNAs等促进了肿瘤的生成和免疫逃逸。晚期NKTCL患者疾病进展更加迅速,常常合并噬血细胞综合症,致死率极高。目前,针对晚期NKTCL患者缺乏标准的一线治疗方案。我们河南省淋巴瘤诊疗中心创立的DDGP方案(吉西他滨+培门冬酶+顺铂+地塞米松)治疗晚期NKTCL显示出较好的疗效,总体缓解率达87.5%且化疗毒副作用小,有望成为晚期NKTCL患者的标准治疗方案。仍有约15%的患者因为原发或者继发耐药导致治疗失败或者疾病缓解后短期复发。对于这部分高危或者复发难治NKTCL患者,如果在疾病治疗前可以准确预测其接受化疗后的疗效,就可以为其制定更优的治疗策略,延长患者生存期、提高生活质量。目前尚没有预测晚期NKTCL患者接受DDGP方案后疗效的可靠标志物。相关研究仅证实外周血EBV-DNA拷贝数与NKTCL患者接受SMILE方案(左旋门冬酰胺酶+甲氨蝶呤+依托泊苷+地塞米松+异环磷酰胺)的疗效和复发率存在相关性。对治疗有效和复发难治晚期NKTCL患者进行血清或者组织差异表达蛋白分析,有望筛选、鉴定与DDGP方案疗效相关的生物学标志物,发现克服肿瘤耐药的精准分子靶点,为晚期NKTCL的靶向治疗和个体化治疗提供科学依据。NKTCL患者肿瘤组织样本少且浸润了大量的免疫炎性细胞,这给我们进行肿瘤组织样本的相关研究带来了很大的困难。血清作为临床患者的珍贵样品,较肿瘤组织样本更容易收集,同时蕴含了大量与疾病转归相关联的有价值信息。机体抗肿瘤免疫防御是一个极其错综复杂的网络体系,在此过程中肿瘤细胞和肿瘤微环境中的免疫细胞、炎性细胞会合成释放一些具有生物效应的蛋白分子并进入循环血液。高通量蛋白质组学技术的发展和成熟,为我们进行血清等复杂样本的蛋白谱分析提供了很好的技术支撑。相对和绝对同位素标记(Isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合液相色谱串联质谱技术(LC—MS/MS)检测低丰度蛋白灵敏度高,蛋白分离能力和分析范围均有质的提高,其定量和定性结果也更加精确。本研究首先采用iTRAQ联合LC—MS/MS技术筛选、鉴定治疗有效和复发难治晚期NKTCL患者治疗前血清差异蛋白分子,扩大血清样本验证候选蛋白分子的表达,寻找NKTCL患者的疗效预测标志物。评价候选蛋白分子表达水平与NKTCL患者临床病理参数、治疗缓解率、早期复发率以及生存时间的相关性,发现晚期NKTCL患者预后的独立因素。候选蛋白分子S100A9在炎症发生及肿瘤的恶性转变、免疫逃逸过程中发挥关键作用,因此我们进一步检测了其在健康人和NKTCL患者血清及组织中的的差异表达情况。同时构建了S100A9重组表达质粒,通过诱导表达、纯化制备S100A9重组蛋白。最后我们观察S100A9蛋白对NKTCL肿瘤细胞生物学特性及小鼠肿瘤生长的影响,初步探讨了分子机制。第一部分复发难治NK/T细胞淋巴瘤的蛋白质组学分析及候选蛋白分子的验证方法(1)收集治疗有效和复发难治晚期NKTCL患者治疗前血清样品,利用亲和色谱柱去除高丰度蛋白分子。(2)胰蛋白酶将血清蛋白裂解为肽段并进行iTRAQ标记,进行强阳离子交换色谱(SCX)分析降低肽段复杂性。(3)利用液相色谱结合串联质谱进行肽段分离和质谱鉴定,并进行定量分析。(4)对组间差异蛋白分子进行生物信息学分析,主要包括GO功能注释和KEGG信号通路富集分析。(5)扩大血清样本ELISA验证候选蛋白分子S100A9和ORM1,检测其作为NKTCL患者疗效预测标志物的敏感性和特异性。(6)分析血清S100A9、ORM1表达水平与患者临床病理参数、缓解率、短期复发率及生存时间的相关性。应用COX回归模型多因素方差分析晚期NKTCL患者预后的独立因素。(7)ELISA检测关键蛋白分子S100A9在健康人和NKTCL患者血清中的表达;免疫组织化学方法检测S100A9蛋白在健康人鼻粘膜组织和NKTCL患者肿瘤组织中的表达;Western blot检测S100A9蛋白分子在NKTCL肿瘤细胞系中的表达。结果(1)患者血清样品合格且高丰度蛋白分子被有效移除,SCX分级共获得12个组分。(2)与治疗有效晚期NKTCL患者相比较,在复发难治患者治疗前血清中共鉴定到83个差异表达蛋白,其中上调蛋白分子共61个,下调蛋白分子共22个。(3)生物信息学分析发现差异蛋白分子主要参与炎症反应、DNA损伤等生物学过程,并富集在趋化因子信号通路、Hippo信号通路等。(4)候选蛋白分子S100A9和ORM1在复发难治患者血清中的表达水平均高于治疗有效患者;血清S100A9单独作为疗效预测标志物的灵敏度和特异性分别为81.5%、71.4%,ORM1单独作为疗效预测标志物的灵敏度和特异性分别为85.2%、77.1%,S100A9联合ORM1作为疗效预测标志物的灵敏度和特异性分别为100%、57.1%。(5)相比血清S100A9低表达患者,S100A9高表达患者的疾病缓解率更低(63.6%vs 93.1%,p=0.006),而早期复发率则更高(66.7%vs 17.2%,p<0.001);相比血清ORM1低表达患者,ORM1高表达患者的疾病缓解率更低(64.5%vs90.3%,p=0.007),而早期复发率则更高(51.6%vs 35.5%,p<0.001)。(6)血清S100A9、ORM1高表达预示着NKTCL患者较差的总生存和无疾病进展生存,S100A9、ORM1、EBV-DNA均是晚期NKTCL患者预后的独立因素。(7)S100A9蛋白在NKTCL患者血清中的表达水平显著高于健康人;S100A9蛋白在NKTCL肿瘤组织的表达显著高于健康人正常鼻腔粘膜组织,并主要由肿瘤间质浸润的免疫炎性细胞表达,而肿瘤细胞不表达S100A9蛋白。NKTCL肿瘤细胞系和正常NK细胞均不表达S100A9蛋白。小结在治疗有效和复发难治晚期NKTCL患者治疗前血清中鉴定到一些具有生物学功能的差异蛋白分子,血清S100A9、ORM1可以作为晚期NKTCL患者疗效预测的可靠标志物,并作为晚期NKTCL患者独立的预后因素存在。S100A9蛋白在NKTCL患者肿瘤组织和血清中的表达升高提示S100A9蛋白可能在NKTCL的发生发展过程中可能发挥重要的作用。第二部分S100A9重组表达质粒的构建以及重组蛋白的表达、纯化和鉴定方法(1)化学合成人源S100A9基因编码区序列全长,PCR扩增S100A9基因并在两端引入Ndel和BamHI酶切位点。(2)用Ndel和BamHI两种限制性内切酶分别酶切S100A9基因PCR产物和表达载体pET-16b,酶切产物纯化后用T4 DNA连接酶进行连接,构建S100A9重组表达质粒。(3)将重组质粒转化E.coli DH5α感受态细胞,挑选若干单克隆进行菌液PCR验证,对阳性转化子少量提取质粒,进行质粒酶切验证和DNA测序验证。(4)将测序正确的重组表达质粒转化Rosetta2感受态细胞,经体外IPTG诱导表达、Ni-NTA Agrose纯化后,采用SDS-PAGE电泳和western blot对获取的S100A9重组蛋白进行鉴定。结果(1)成功构建S100A9重组表达质粒pET-16b-S100A9,经菌液PCR、质粒酶切及质粒DNA测序验证,重组表达质粒含有人源S100A9基因编码区全长。(2)通过重组表达质粒转化及蛋白诱导表达、纯化以及浓缩获得重组蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示表达蛋白符合人源S100A9蛋白。小结成功构建含有人源S100A9基因编码区序列的重组表达质粒pET-16b-S100A9,经诱导表达、纯化制备S100A9重组蛋白,为开展后续的功能研究提供了材料。第三部分S100A9重组蛋白对NKTCL肿瘤细胞生物学特性的影响及机制研究方法(1)采用CCK-8试验检测S100A9重组蛋白对NKTCL肿瘤细胞(YT和SNK-6)增殖的影响。(2)采用流式细胞术检测S100A9重组蛋白对NKTCL肿瘤细胞(YT和SNK-6)凋亡和细胞周期分布的影响。(3)Western blot检测S100A9蛋白作用后肿瘤细胞内PD-L1表达水平的改变。(4)检测肿瘤细胞表面S100A9蛋白结合的受体靶点,实验共分为四组:空白组、S100A9蛋白组、RAGE或TLR4受体抑制剂组、S100A9蛋白+RAGE或TLR4受体抑制剂组。(5)Western blot检测S100A9蛋白作用后肿瘤细胞内重要信号通路分子p65、ERK1/2、JNK1/2、p38 MAPK磷酸化表达水平及总蛋白表达水平的改变。(6)将ERK1/2特异性抑制剂和S100A9蛋白共同作用于肿瘤细胞,检测分析肿瘤细胞增殖和肿瘤细胞内PD-L1的表达的改变。实验共分为四组:空白组、S100A9蛋白组、ERK1/2抑制剂组、S100A9蛋白+ERK1/2抑制剂组。(7)观察S100A9蛋白拮抗剂Tasquinimod对NKTCL荷瘤小鼠肿瘤生长的影响。结果(1)中、低浓度的S100A9蛋白可以促进肿瘤细胞YT和SNK-6的增殖,高浓度的S100A9蛋白对肿瘤细胞增殖的促进效应并没有进一步增强。(2)S100A9蛋白对YT和SNK-6肿瘤细胞的凋亡率没有显著影响(p>0.05);S100A9蛋白作用后肿瘤细胞G1期细胞比例降低而S期细胞比例升高。(3)S100A9蛋白作用YT和SNK-6细胞后,肿瘤细胞内PD-L1的表达逐渐增高。(4)阻断RAGE受体后,减弱了S100A9蛋白对肿瘤细胞增殖的促进作用和对PD-L1的诱导表达;阻断TLR4受体后,S100A9蛋白对肿瘤细胞增殖的促进作用和PD-L1的诱导表达不受影响。(5)S100A9蛋白作用YT和SNK-6细胞后,肿瘤细胞内磷酸化ERK1/2表达水平显著升高,而p65、JNK1/2、p38 MAPK等磷酸化水平未见明显改变;应用RAGE受体抑制剂后,S100A9蛋白对ERK1/2信号的活化作用减弱。(6)ERK1/2特异性抑制剂联合S100A9蛋白作用YT和SNK-6细胞后,肿瘤细胞的增殖率和PD-L1的表达较S100A9蛋白单独作用时下降;ERK1/2抑制剂减弱了S100A9蛋白对肿瘤细胞增殖的促进效应和对PD-L1表达的诱导效应。(7)给予小鼠S100A9蛋白拮抗剂Tasquinimod后,小鼠肿瘤生长显著迟缓于生理盐水对照组小鼠。小结S100A9蛋白可促进NKTCL肿瘤细胞的增殖并诱导PD-L1的表达,主要通过与肿瘤细胞表面RAGE受体的结合以及活化ERK1/2信号通路实现。阻断S100A9蛋白与RAGE受体的结合减弱了S100A9蛋白对肿瘤细胞增殖的促进效应及对PD-L1表达的诱导效应,并抑制了小鼠肿瘤组织的生长。全文结论1.本研究发现血清S100A9和ORM1是晚期NKTCL患者疗效预测的标志物,也是晚期NKTCL患者预后的独立因素2.本研究成功构建了S100A9重组表达质粒,制备了His-tag标签的S100A9重组蛋白3.本研究发现S100A9蛋白通过细胞表面RAGE受体介导的ERK1/2信号通路活化促进NKTCL肿瘤细胞增殖和PD-L1的表达,以S100A9为靶点的治疗可以抑制小鼠肿瘤生长