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目的:斑蝥作为一种传统的中药因其具有破血逐瘀、散结消癥、攻毒蚀疮的功效而被古代医家广泛应用。斑蝥素(Cantharidin,CTD)来源于斑蝥的干燥体,是一种有效的抗肿瘤中药成分。现代研究表明,CTD可以用来治疗肝癌、乳腺癌、肺癌、食管癌、结肠癌等恶性肿瘤。但临床研究表明,CTD能够对泌尿道以及消化道产生较严重的毒性,因此使其临床用药受到限制。目前肿瘤的治疗过程中仍以手术切除配合放、化疗为主要手段,而在化疗过程中为增加药物的治疗效果,多采用联合用药的方法进行治疗。因此,本实验的实验目的就是通过药物及细胞株的筛选确定能够使CTD增效减毒的联合用药方法并通过细胞及分子水平的研究初步确定其作用机制。方法:1、应用长时间细胞观察及功能分析系统(IncuCyteTM ZOOM)通过观察药物对细胞生长增殖的影响来初步筛选与CTD有联合作用效果的药物及起效细胞株。2、应用CompuSyn软件根据Chou-Talalay计算方法计算联合作用指数CI(combination index),从数学角度评价药物的联合作用效果。3、通过细胞克隆形成实验进一步从细胞增殖水平来验证联合作用效果。4、应用流式细胞术检测两药联合对细胞凋亡及周期的影响。5、采用蛋白免疫印迹法检测两药联合对细胞半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)及聚二磷酸腺苷核糖多聚酶(PARP)蛋白表达的影响,进而从蛋白表达水平验证联合用药对细胞凋亡的影响。6、应用β-半乳糖苷酶衰老染色实验检测两药联合对细胞衰老的影响。结果:1、通过IncuCyteTM ZOOM的初步筛选,我们发现培美曲塞(Pemetrexed,MTA)与CTD对结直肠癌HCT116细胞具有较好的联合作用效果,且当CTD的浓度为4μmol·L-1 MTA的浓度为50 nmol·L-1时两药的联合作用效果最佳。2、IncuCyteTM ZOOM分析结果显示:与空白组相比,联合用药组细胞的生长增殖水平受到明显抑制(P<0.01);联合用药组细胞的生长抑制率明显高于CTD处理组(P<0.05)且明显高于MTA处理组(P<0.01)。3、CompuSyn软件计算结果表明:当生长抑制率Fa(fractionaffected)小于1时大部分的CI值小于1,且Fa越小CI值越小;当Fa值介于0.2-0.6之间时,CI值介于0.5-0.6之间。4、克隆形成实验结果表明:联合用药组与空白组、CTD单药处理组及MTA单药处理组相比,HCT116细胞克隆形成能力均有明显下降(P<0.01,P<0.01,P<0.01);单药处理组的克隆形成能力较空白组也有较为明显的下降(P<0.01,P<0.01)。5、流式细胞术检测细胞凋亡结果表明:联合用药组与空白组、CTD单药处理组及MTA单药处理组相比,HCT116细胞凋亡水平均明显上升(P<0.01,P<0.01,P<0.01);单药处理组的凋亡水平较空白组有较为明显的上升(P<0.05,P<0.05)。6、流式细胞术检测细胞周期结果表明:与空白组相比,MTA处理组使HCT116细胞产生S期阻滞;CTD处理组增加了 G2/M期细胞的含量;联合用药组增加了 S期及G2/M期细胞的含量。7、Western blot实验结果表明:联合用药组与空白组相比,显著降低pro-caspase 3的表达量(P<0.05)、显著升高cleaved-PARP的表达量(P<0.01);与MTA处理组相比,显著降低pro-caspase 3的表达量(P<0.01)、显著升高cleaved-PARP的表达量(P<0.01);与CTD处理组相比,显著升高cleaved-PARP的表达量(P<0.01)。8、β-半乳糖苷酶衰老染色实验结果表明:联合用药组与空白组、CTD单药处理组及MTA单药处理组相比,HCT116细胞衰老水平明显升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05);MTA处理组与空白组相比能够诱导较多的细胞衰老(P<0.01),而CTD处理组则无明显的细胞衰老现象。结论:1、经过IncuCyteTM ZOOM的初步筛选、联合作用指数CI的计算以及克隆形成实验的验证我们可以初步确定CTD与MTA对结直肠癌细胞HCT116具有较好的联合作用效果。2、MTA与CTD联合用药能够增加HCT116细胞的凋亡及衰老并改变细胞的周期分布。3、MTA与CTD联合用药能够改变HCT116细胞凋亡相关蛋白pro-caspase 3及cleaved-PARP的表达水平。