西瓜作为一种以鲜食为主的水果,果实含糖量是评价西瓜品质的最核心指标,一直是西瓜品种改良与栽培中最为重要的目标性状。然而,西瓜含糖量是由多基因控制的复杂数量性状,并存在明显的环境互作效应,传统的生理与遗传学研究方法很难分析其遗传本质与调控机制,进一步明确在复杂的糖代谢和糖转运基因网络中哪些节点是影响和决定西瓜果实糖积累的关键基因,不仅可为西瓜品质改良提供理论与技术指导,而且也为探索作物光合产物积累与转运的分子机制奠定坚实基础,因此本项目研究具有重要理论意义与实用价值。本文通过构建高密度SNP遗传图谱与全基因组关联分析(GWAS)方法,完成含糖量性状QTL精细定位,试图明确西瓜含糖量遗传控制位点。在此基础上,对QTL区域的糖转运蛋白基因的结构变异、表达模式、亚细胞定位、功能验证和调控机制进行了初步分析,取得的主要研究结果如下。1.西瓜整合图谱构建及含糖量QTL初定位。利用4个独立的遗传群体构建了一张整合图谱。4个独立的遗传群体分别为:东亚栽培种97103和野生种PI 296341-FR杂交单粒传构建的103株系重组自交系(RILs);北美栽培种ZWRM50×野生种PI 244019(ZWRM×citron)杂交构建的182单株的F2群体;164株系的栽培种×栽培种[Klondike Black Seeded×New Hampshire Midget(KBS×NHM)]RIL群体;187单株的栽培种×半野生种[Strain II×PI 560023(SII×egusi)]F2群体。该整合图共计包含标记1339个,遗传距离798cM,平均标记间距0.6cM。整合图谱共计包含58个已经发表的QTL和12个新发现的QTL,其中新发现的QTL包括西瓜折光糖含量(Brix)、果糖(Fru)、蔗糖(Suc)和葡萄糖(Glu)含量QTL。通过整合图谱将西瓜折光糖含量主效QTL(Brix)定位于chr2(QBRIX2-1、QBRIX2-2及QBRIX2-3),该3个主效QTL均与果糖含量QTL(QFRU2-1、QFRU2-2和QFRU2-3)重合。其中2个QTL(QBRIX2-1和QBRIX2-3)与蔗糖含量QTL(QSUC2-1和QSUC2-2)重合。通过整合比较分析不同群体下定位的含糖类QTL发现QBRIX2-1,QBRIX2-2及QBRIX2-3均能在不同遗传背景下被检测到,且位于整合图谱同一区间,表明这些QTL能够解释广泛背景下的遗传变异。2.RIL重测序SNP图谱构建与含糖量QTL精细定位。对栽培西瓜97103与野生西瓜PI296341-FR为亲本构建的RIL群体96个单系进行了重测序。从94.7万个SNP位点选取高质量的SNP构建2777 Bin,利用2777 Bin构建RIL SNP Bin遗传图,SNP遗传图共计包含SNP Bin 2539个,遗传距离总1565.0cM。利用超高密度RIL SNP Bin遗传图,将97103基因组386个scaffolds大约344 Mb(占组装基因组355.2Mb的96.9%)锚定到西瓜11条染色体,共计有314 scaffolds(332.6 Mb)大约占93.6%组装序列确定方向,较西瓜基因组发表版本仅65%的scaffold确定方向有明显提高。通过超高密度RIL SNP Bin图将西瓜含糖量QBRIX2-1和QBRIX2-2分别精细定位在125 Kb(16 genes)和797 Kb(20 genes)之间。利用和高糖亲本97103遗传相似度高达84.3%的RIL-G35与97103构建BC2F2近等基因系群体将QBRIX2-3进一步定位到Indel标记WMI251和WMI233之间,包含87个基因,其中有6个转录因子,其中bHLH家族转录因子998在亲本97103和PI296341中存在蛋白差异且判断为有害突变,可能会影响基因功能。3.QBRIX2-1区间转运蛋白基因835转录水平、结构变异、组织特异性表达及其与QBRIX2-3的互作模式解析。含糖量QBRIX2-1精细定位在125 Kb之间,涉及到16个候选基因。转录组分析发现仅一个msf家族转运蛋白基因835在高糖材料97103果实成熟4个关键时期高量上调表达,而在低糖材料pi296341果实成熟4个关键时期无表达,在97103果皮、根和叶部也呈低表达,q-pcr检测约50份典型重测序材料835表达发现其表达量与含糖量正相关,确定为qbrix2-1的候选基因。race扩增835在高糖材料和低糖材料中全长cds及5’和3’端序列发现835在高糖材料5’utr区up37bp存在一个snp(a/c),可导致高糖材料和低糖材料翻译框架改变:高糖材料减少45个氨基酸。检测该snp在130份重测序材料中发现brix大于4的材料均为a,而低于4的材料均为c,不仅可区分栽培和野生种之间糖分差异,还能有效区分半野生资源内部高糖和低糖材料,因此该snp可作为自然群体糖分检测的分子标记互助选择。45氨基酸短肽为信号肽,亚细胞定位发现其可影响97103-835和pi296341-835蛋白定位:97103-835蛋白表达在质膜,而pi296341-835蛋白主要表达在内膜系统。rna原位杂交显示97103-835特异性在高糖品种果实维管束系统表达,这表明97103-835可能是参与果实韧皮部糖分卸载,而非果肉细胞糖分装载。为明确高糖材料97103和低糖材料pi296341中835数千倍差异表达的机制,分析启动子发现上游1187bp存在一个myc(bhlh)e-box(canntg)识别位点差异:caaatg->caaagg。以此e-box位点为诱饵序列,筛选97103cdna酵母单杂交文库,发现位于qbrix2-3的转录因子998可结合该e-box元件。以烟草瞬时表达系统共表达998和835启动子1700bp启动的luc荧光素蛋白,结果显示998能有效激活97103-835启动子1700bp,而不能激活pi296341-835启动子1700bp区域。充分证明该基因启动子区域e-boxmotif的snp改变导致了转录活性差异,从而明确qbrix2-3对qbrix2-1的转录调控机制。4.qbrix2-2区间糖转运蛋白基因cltst2的表达谱分析、功能初析及调控因子。qbrix2-2涉及20个候选基因,从蛋白功能注释分析只有cltst2属于tmt家族糖转运蛋白;转录组分析发现cltst2在高糖材料97103果实成熟过程4个关键时期上调表达,而在低糖材料pi296341果实成熟4个关键时期下调表达,q-pcr检测约50份典型重测序材料cltst2表达发现其表达量与含糖量正相关,故将转运蛋白基因cltst2确定为qbrix2-2的候选基因。将目标基因转入带yfp的植物表达载体,转化西瓜果实原生质体,结果表明转运蛋白cltst2在西瓜液泡中表达。膜片钳技术检测表明cltst2具有单糖(葡萄糖、果糖)和二糖(蔗糖)转运功能;将cltst2瞬时表达于草莓的白果期,表达3-4天后可以明显观察到cltst2过表达草莓能够较表达空载体的草莓积累1.5倍的糖分。酵母单杂交和emsa结果表明waky家族clsusiba2能有效结合cltst2的wbox和糖响应顺式作用元件。烟草瞬时表达发现97103-pcltst2::luc和pi296341-fr-pcltst2::luc均被clsusiba2抑制表达。分析其表达模式发现cltst2在低糖材料(组织)中被clsusiba2抑制,而在高糖材料中,随着果实成熟,不断解除了其对cltst2的抑制,使cltst2表现出不断升高的表达趋势。5.gwas发现糖分积累相关基因clswt及其转录水平、功能解析。以130份重测序自然群体材料约100万snp数据进行全基因组关联分析,在chr1短臂末端378844附近获得了西瓜糖分含量snp,该snp位于clswt,与130份重测序自然群体糖分含量吻合度达86%。转录组分析发现,clswt在高糖材料97103果实成熟4个关键时期高量上调表达,而在低糖材料pi296341果实成熟4个关键时期无表达,q-pcr检测约50份典型重测序材料clswt表达发现其表达量与含糖量正相关,确定为候选基因。clswt转化己糖吸收缺陷酵母菌种ysl2-1后,能互补其果糖和葡萄糖吸收功能,证明其具有果糖和葡萄糖转运能力。6.西瓜糖分积累机制网络节点模式图绘制。水苏糖、棉籽糖是西瓜韧皮部运输的主要糖分,主要由α-半乳糖苷酶(AGA)将水苏糖、棉籽糖分解为蔗糖,此为糖分果实卸载第一关键节点。韧皮部维管束中蔗糖被酸性转化酶分解成果糖和葡萄糖后从韧皮部卸载,此为糖分运输第二关键节点,可能由QBRIX2-1 835参与协助,并由bHLH家族转录因子控制表达。糖分运输第三关键节点为果肉细胞质膜上糖分运输,为本研究已证明功能ClSWT控制。第四个关键节点为果肉细胞液泡膜上质子反向转运体ClTST2,由WRKY家族转录因子调控。本研究首次绘制了西瓜糖分运输关键节点图,并初步确定每个节点可能的控制基因,为西瓜果实糖分积累奠定了分子改良的理论基础,具有重要理论意义与商业实用价值。