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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck hepatitis virus,DHV)引起的主要针对雏鸭的一种高度致死性病毒传染病。其中分布最广危害最大的为1型鸭甲肝病毒(DHAV-1)。本研究通过对DHAV-1的3A蛋白进行原核表达及纯化,然后制备鼠抗3A蛋白多克隆抗体,通过间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescence,IFA)确定了3A蛋白在重组质粒表达中和病毒感染中的亚细胞定位;建立的基于原核表达的3A蛋白的检测DHAV-1抗体的间接ELISA方法。1、DHAV-13A的原核表达、纯化、鉴定及鼠抗3A蛋白血清的制备通过PCR获得去掉3A基因跨膜区的3A截短基因片段(198bp),将目的片段亚克隆至pET-32a(+),构建重组质粒pET-32-3A-198。将重组质粒转化入表达菌BL21(DE3)后诱导表达约为31kD的3A截短蛋白,命名为3A-198。以O.1mmol/LIPTG、37℃诱导6h获得最大表达量,蛋白均表达于上清。采用Ni亲和层析柱法纯化3A-198,Western bolt结果表明3A-198可被鸭抗DHAV-1血清识别,反应原性良好。使用获得的纯化后3A-198蛋白免疫小鼠,经过4次免疫后获得琼扩效价约为1:8的鼠抗3A-198血清。2、3A蛋白在鸭胚成纤维细胞的亚细胞定位构建了 3A的真核表达质粒pCMV-myc-3A,Western blot结果表明真核表达质粒在鸭胚成纤维细胞中的表达产物能够被抗3A-198多克隆抗体识别,且条带大小与3A-myc重组蛋白大小相符,说明重组质粒能够成功表达3A蛋白。分别在病毒感染和转染重组质粒pCMV-myc-3A于鸭胚成纤维细胞中的情况下,以获得的鼠抗3A-198血清作为一抗,在处理后48h获得的鸭胚成纤维细胞飞片上,通过间接免疫荧光的方法将其分别与细胞中的高尔基体和内质网进行共定位。结果表明3A蛋白主要定位于内质网上,与高尔基体并无明显的共定位信号3、基于DHAV-1 3A蛋白的间接ELISA方法的建立通过对3A蛋白间接ELISA条件的优化,得到了以3A-198作为抗原的间接ELISA检测方法,其最佳条件为:以6.185μg/mL蛋白浓度于4℃下包被过夜,采用5%BSA的PBS封闭90min,加入被检血清(1:20稀释)37℃孵育30min,以HRP标记的兔抗鸭IgG(1:2000稀释)37℃孵育30min,最后显色液室温避光孵育10min。确定阳性阈值为0274。所建立的方法具有较好的敏感性、重复性和特异性,能够同样检测出DHAV-3抗体,与以DHAV-1病毒作为抗原的间接ELISA检测方法的整体符合率为92.7%,可用于DHAV血清抗体的检测。