论文部分内容阅读
研究发现五环三萜类化合物具有较好的抗肿瘤活性,齐墩果酸衍生物(Oleanolic Acid Derivatives, OAD)是一种五环三萜类化合物,本研究旨在探讨其对人肝癌细胞系SMMC-7721的作用及其机制。方法：(1)应用不同浓度的OAD作用于人肝癌细胞系SMMC-7721(以下简称SMMC-7721细胞)和人肝细胞HL-7702(以下简称HL-7702细胞),通过对MTT法对细胞生长曲线的测定、光学显微镜法对细胞病变的观察,研究OAD的细胞毒性作用。(2)通过光学显微镜法观察细胞膜通透性、线粒体膜电位(△Ψm)的荧光改变情况,应用分光光度计检测细胞内ATP的含量,酶联免疫法检测胞浆及线粒体内Cyt-C的含量,Western-blotting检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、pro-caspase-9、cleaved-caspase-9、pro-caspase-3、cleaved-caspase-3的蛋白表达水平,研究OAD诱导SMMC-7721细胞发生凋亡的机制。(3)采用qRT-PCR和Western-blotting技术检测不同浓度的OAD在不同时间点对SMMC-7721中Wnt/β-catenin信号通路中关键分子P-catenin、 c-myc和cyclin D1基因及蛋白水平的影响,Western-blotting技术进一步检测了β-catenin核转移水平以及β-catenin磷酸化水平,研究OAD对SMMC-7721细胞中WVnt/p-catenin信号通路的作用机制。结果：(1)OAD能引起SMMC-7721细胞皱缩、胞膜起泡以及凋亡小体的产生,15μM O AD在24h、48h、72h對SMMC-7721细胞的最大抑制率分别是30.30%、63.00%、82.46%,对HL-7702的最大抑制率分别是37.20%、64.45%、84.68%,且呈时间和剂量依赖性。(2)7μM、9μM、11μM OAD作用于SMMC-7721细胞12h、24h、36h后,可引起SMMC-7721细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS)外翻,经由Annexin V-FITC/PI双染后的SMMC-7721细胞膜绿色荧光及红色荧光均有所增加,且呈时间和剂量依赖性,即OAD可破坏SMMC-7721细胞膜的通透性,OAD作用于SMMC-7721细胞48h后抗凋亡蛋白Bcl-2被下调而促凋亡蛋白Bax被上调,并且促进了pro-caspase-9 和 pro-caspase-3的裂解,说明OAD促使SMMC-7721细胞发生了凋亡过程。(3)OAD处理SMMC-7721细胞后下调了细胞线粒体内ATP水平,当OAD浓度为11μM时,由细胞组的1648.46μmol/gprot降低为374.51 μmol/gprot,OAD还促进了线粒体内Cyt-C的释放,当OAD浓度为11μM时,线粒体Cyt-C的含量由细胞组的116.30nmol/L减少为40.15 nmol/L。与空白细胞组和DMSO组相比较,各浓度OAD药物处理组细胞中的红／绿荧光比例随着药物浓度的增加和时间的延长而减小。可见,OAD降低了SMMC-7721细胞线粒体膜电位(△ψm)。(4)OAD能下调SMMC-7721细胞Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin、c-myc和cyclin D1的基因及蛋白表达水平,并可抑制β-catenin的核转移和增加胞浆内β-catenin在Ser33/37/Thr41位点的磷酸化水平。结论：(1)OAD能抑制SMMC-7721细胞的增殖并引起细胞线粒体功能紊乱而诱导SMMC-7721细胞凋亡。(2)OAD通过抑制β-catenin的核转移以及增加β-catenin的磷酸化(Ser33/37/Thr41)水平来抑制SMMC-7721细胞中wnt/β-catenin信号通路的激活,从而诱导SMMC-7721细胞发生凋亡。综上所述,OAD有望成为一种新型的、有效的抑制肝癌细胞增殖、诱导凋亡的抗肝癌中药单体药物。