心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)是导致人类死亡和劳动力丧失的重要因素,其发病率和死亡率已经超越肿瘤位居第一。动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是引起冠状动脉疾病、中风等多种心血管疾病的共同的病理基础,是当前人类需要攻克的一大难题。AS的发病机制较为复杂,致病因素较多,目前以他汀类为代表的降脂药物被广泛应用于临床治疗,尽管取得了一定效果,但是CVD的发病率和致死率依然逐年上升,同时长期给药带来的不良反应也对患者造成较大困扰,因此寻找有效的治疗药物、构建适宜的药物递送系统对于防治CVD具有重要意义。雷帕霉素(Rapamycin,RAP)因具有良好的抗增殖活性被广泛用于器官移植后抗排斥反应和抑制冠状动脉支架植入术后再狭窄。RAP的靶点为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR),它是调节细胞内脂质、蛋白、能量水平的重要因子。通过调节m TOR信号通路,RAP具有抗炎、抑制平滑肌细胞增生、迁移和促进自噬选择性杀灭巨噬细胞等多重作用,因而具有潜在的抗AS作用。目前对于RAP在动物体内抗AS作用还不明确,其AS防治作用有待进一步确证。另一方面,RAP较强的疏水性导致其传统剂型给药后生物利用度低,不利于其疗效的发挥。同时,RAP的传统剂型在释放时间和释放位点两个方面的控制均不理想,限制了其疗效的发挥,亦会带来较大的不良反应。因而,构建适用于不同给药途径的、具有良好临床应用前景的新型RAP释药系统,对于发挥RAP的有效活性意义重大。针对上述问题,本课题的主要研究目的是构建不同的RAP微粒释药系统,以为其疗效的最大化发挥提供潜在的新型药物制剂。为此,首先在小鼠体内评价了RAP的抗AS作用;然后,通过主-客体作用介导的自组装方法构建了RAP口服微粒系统,通过缩醛化β-环糊精材料构建了适用于局部注射给药的RAP缓释微粒,并通过具有病灶微环境响应性的功能化β-环糊精材料构建了靶向性RAP纳米释药系统。与传统的RAP制剂相比,这些不同的释药系统各具优势,并能更好地发挥RAP的抗AS作用,为其临床防治AS的应用奠定了坚实的基础,同时也为RAP的临床应用提供了多种新型的候选剂型。方法1.载体材料的合成1.1.聚(n-异丙基丙烯酰胺)(pnipam)的合成通过自由基聚合来合成pnipam。其中,单体n-异丙基丙烯酰胺与引发剂偶氮二异丁腈(aibn)的摩尔比为50:1,聚合溶剂为无水甲醇,60℃反应24小时后乙醚沉淀,透析纯化后冻干即得。1.2.缩醛化β-环糊精(ac-bcd)的合成将1gβ-环糊精(β-cd)溶于10ml无水二甲基亚砜(dmso)中,25℃磁力搅拌溶解,加入16.3mg吡啶对甲苯磺酸盐(pts),待溶解后加入4ml2-甲氧基丙烯(mp),反应180分钟后加入0.2ml三乙胺终止反应,足量去离子水中析出产物,离心水洗后冻干。1.3.氧化响应性β-cd(ox-bcd)的合成将5.55g对羟甲基苯硼酸频哪醇酯(pbap)加入到36ml无水二氯甲烷(dcm)中溶解,加入7.65gn,n’-羰基二咪唑(cdi),室温磁力搅拌60分钟后加入40ml无水dcm,去离子水洗涤3次,再用饱和nacl溶液漂洗除去有机相,na2so4干燥得到cdi活化的pbap。然后,将1.52gcdi活化的pbap和250mgβ-cd共溶于20ml无水dmso中,加入0.8g4-二甲氨基吡啶(dmap),25℃搅拌过夜,80ml去离子水沉淀后离心水洗得到白色粉末样产物。上述制备的材料均通过氢核磁共振光谱法(1hnmr)和傅立叶变换红外光谱法(ftir)确证其结构,凝胶渗透色谱法(gpc)测定分子量。2.载药微粒的制备2.1.口服微粒系统的制备rap口服微粒系统通过自组装法制备,具体来说:将rap、吲哚美辛(ind)和pnipam以不同比例共溶于1mldmso中,置于截留分子量为3500da的透析袋中,25℃磁力搅拌下在去离子水中透析,适时更换外水相,24小时后离心、水洗得pnipam/ind/rap载药微粒。采用类似的方法制备得到rap、舒林酸(sul)和pnipam载药微粒,即pnipam/sul/rap微粒。另一方面,基于聚(乳酸-共-乙醇酸)(plga)和肠溶衣材料s100的口服微粒通过乳化法制备。简单来说,称取80mgplga、20mgrap共溶于3mldcm中,将其倒入30ml含有2wt%聚乙烯醇(pva)的水溶液中,超声乳化后磁力搅拌3-4小时,16000rpm离心、水洗后冻干即可。制备s100微粒时,称取80mgs100溶于3ml乙醇中,将其加入至9ml溶有20mgrap的dcm溶液中,将此混合有机溶液倒入60ml含有2wt%pva的水溶液中,超声乳化,磁力搅拌3-4小时,16000rpm离心、水洗后冻干。2.2.rap缓释微粒的制备基于ac-bcd材料的rap缓释微粒通过乳液-溶剂挥发法制备。首先称取50mgac-bcd和20mgrap,共溶于0.6mldcm中,将所得有机溶液倒入6ml含有1wt%pva的磷酸盐缓冲溶液中,超声乳化,将所得乳液倒入20ml含有0.3wt%pva的pbs中,室温搅拌3-4小时,16000rpm离心、去离子水洗涤,反复洗涤4-5次得rap/ac-bcd缓释微粒,即rap-np。2.3.响应性rap载药纳米粒的制备基于不同响应性材料的rap载药纳米粒通过纳米沉淀法制备,同时选择plga为非响应性对照材料。首先,称取10mg卵磷脂溶解于1ml无水乙醇中,取0.4ml卵磷脂乙醇溶液加入到9.6ml含有6mg磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(dspe-peg)的水溶液中,65℃搅拌充分混合。将50mg载体材料溶于2ml有机溶剂中,其中plga和ac-bcd溶解于乙腈中,ox-bcd溶解于体积比为1:1的甲醇-乙腈混合溶剂中。将含有不同载体材料的有机溶液逐滴加入水相中,同时搅拌,室温孵育120分钟,15000rpm离心水洗后冻干,得rap/plga、rap/ac-bcd和rap/ox-bcd微粒系统。3.载药微粒的表征称取少量样本分散于水中,吸取足量混悬液滴于铜网膜和云母片上,室温挥干,分别进行透射电镜(tem)和扫描电镜(sem)观察。将剩余混悬液稀释后加入比色杯中,通过动态光散射法测定样品的粒径大小及其分布。另称取少量样本溶于dmso中,紫外分光光度计法(uv)或液相色谱法(hplc)测定rap的含量,计算其载药量和包封率。4.药物与载体材料间分子作用力的研究通过计算模拟分析rap与载体材料pnipam间的相互作用,采用moe软件生成rap、pnipam三维构象,从zinc数据库中下载得到ind构象,应用mmff94x力场进行能量最小化分析,采用autodock对pnipam、rap、ind和水分子之间的相互作用力进行两两或者多分子对接,采用lga算法计算分子间结合能大小。5.rap载药微粒的体外释放动力学研究称取适量载药微粒混悬于不同ph值的pbs或含有h2o2的pbs中,置于37℃孵箱中,不同时间点离心后取出部分释放液,再分散后加入同等体积的新鲜溶液。测定药物浓度,origin软件绘制药物累积释放曲线。6.载药微粒的体内药动学研究分别将载药微粒经口服、皮下等不同途径给药于spraguedawley(sd)大鼠或者c57小鼠体内,在设定时间点取血、制备检测样本,采用高效液相色谱-质谱法(hplc-ms)检测药物浓度,药动学参数经das软件处理得到。7.as模型的建立及不同治疗方案8周龄载脂蛋白e缺陷(apoe-/-)小鼠用含有0.25%胆固醇的高脂饲料喂养共3个月,第1个月后分组并给予不同的rap载药微粒及相应对照品,经过2个月干预后处死小鼠,收集主动脉、血液等不同组织样品。其中,自组装rap微粒、rap/plga及rap/s100微粒通过口服给药,每3天给药一次,剂量为3mg/kg;rap/ac-bcd缓释微粒皮下注射给药,每15天给药一次,高、低剂量分别为3和1mg/kg,对照原料药组口服给药,每3天给药一次,剂量为3mg/kg;不同响应性的rap纳米粒均通过腹腔注射给药,每3天给药一次,剂量为3mg/kg。8.主动脉斑块面积分析主动脉斑块面积大小通过油红o(oro)染色进行分析。具体方法为,首先将主动脉组织用10%福尔马林固定50分钟,剔除血管外膜多余组织,纵向剖开主动脉,然后将其与含有0.25wt%oro的异丙醇/水(60:40)溶液在37℃孵育15分钟,最后用60%异丙醇水溶液浸洗三次,体视显微镜下观察拍照。同时,对主动脉根部和头臂干动脉切片进行了oro染色分析。具体来说,使用oct包埋剂包埋血管组织,将其于-20℃放置30分钟后,制备8μm连续横片贴于载破片上,60℃烘箱放置3小时,水洗后,用0.25wt%oro溶液染色,甘油/pbs(1:1)封片后镜下观察拍照,统计分析oro染色面积。9.主动脉切片的组化分析石蜡包埋主动脉根部血管,制备6-μm连续切片,苏木精-伊红(he)与masson分别染色后镜下观察拍照。另一方面,对4-μm切片进行脱蜡处理,60℃烘干,3wt%过氧化氢和甲醇封闭20分钟,洗掉多余溶液,表面覆盖2ml含有0.3wt%tritonx-100和1.0wt%胎牛血清白蛋白的pbs溶液,孵育60分钟后清洗,分别与anti-cd68、anti-mmp-9、anti-α-sma抗体孵育过夜,洗净封片后采集图像。10.小鼠血清中炎症因子的测定小鼠右眼静脉丛取血,室温放置180分钟,3000rpm离心20分钟,取上层血清。然后,按照炎症因子芯片标准流程测定血清中肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、干扰素-γ(inf-γ)、白介素-1α(il-1α)、白介素-1β(il-1β)、白介素-6(il-6)和巨噬细胞趋化因子-1(mcp-1)的水平。11.rap对mtor信号通路的作用研究将大动脉根部至髂动脉分叉间血管洗净置入研磨器,加入1ml含有磷酸化酶和非磷酸化酶抑制剂的裂解液,充分研磨均匀静置30分钟,3000rpm离心取上层清液。细胞水平研究选用小鼠平滑肌细胞(movas),首先将movas细胞铺板(1×106/孔),在含有1%胎牛血清的1640培养基中孵育24小时,之后加入不同剂量的rap,孵育一定时间后收集细胞裂解液。采用millipore液态芯片检测组织和细胞内mtor信号通路相关蛋白的表达水平,并进行分析。12.主动脉组织ros水平的测定截取主动脉根部至髂动脉分叉间动脉,称重后加入1ml生理盐水,充分匀浆后,3000rpm离心收集上清液。按elisa试剂盒标准流程操作。具体而言,设标准品、空白和样品孔,分别加入标准浓度溶液、去离子水和样本,封板孵育30分钟,洗净后除空白组外每孔加入50μl酶标溶液,密封后37℃下孵育60分钟,洗涤后每孔先后加入50μl显色剂a和b,避光反应15分钟后加入终止液,450nm处测od值。13.响应性纳米粒靶向as斑块的评价apoe-/-小鼠高脂喂养3个月后,分别腹腔注射cy5标记的纳米粒和游离cy5染料,24h后收集主动脉组织和其他主要脏器,并采用活体成像系统观察荧光分布情况,重点考察主动脉组织的荧光强度。另外,将经过活体成像观察的血管组织采用oct包埋剂包埋后制备冰冻切片,4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色细胞核后采用共聚焦观察斑块内荧光分布情况。14.微粒释药系统的初步安全性评价小鼠经口服、皮下注射或腹腔注射不同rap微粒释药系统,药物干预期间,称量记录小鼠体重等基本指标;实验结束后处死小鼠,取血清测定血脂、血常规、肝肾功等生化指标;收集心、肝、脾、肺、肾,称重并计算各脏器指数;各脏器石蜡切片he染色后进行病理学观察。结果1.通过自由基聚合合成了pnipam,gpc测得其分子量为53973。采用mp为缩醛化试剂,通过动力学控制的缩醛化反应成功合成了缩醛化β-cd(ac-bcd),其中线性与环状缩醛基团的摩尔比为0.62:1;通过将pbap化学键合于β-cd,制备得到了氧化响应性的β-cd材料(ox-bcd),其中每个β-cd单元含有11个pbap单元。2.基于ind或sul介导的pnipam的自组装成功将rap负载于微粒中,得到平均粒径在600-800nm的载药微粒;其载药量随着投药比的增加而升高,最高接近60%;通过乳化法制备的plga和s100载药微粒,平均粒径在600nm,其rap载药量分别为18.1%和17.2%。分子间动力学模拟结果表明rap、ind、pnipam之间存在疏水作用,氢键作用、范德华力和静电作用,因此能够克服rap分子间自身的结晶力,使rap以无定型的形式被包裹于聚合物中,从而更有利于药物的溶出,提高其体内生物利用度。3.采用水包油乳化法成功将rap包裹于ac-bcd微粒中得到rap-np,其平均粒径为250nm,载药量27.2%,sem和tem观察表明rap-np呈规则球状,且分散均匀。4.以plga、ac-bcd和ox-bcd分别为疏水载体材料,采用纳米沉淀-自组装法成功制备得到具有不同响应性的rap纳米粒,即rap/plganp、rap/ac-bcdnp和rap/ox-bcdnp,三种纳米粒的平均粒径均在250nm左右,载药量分别为8.0%、12.5%和7.0%,sem和tem观察表明,纳米粒均呈规则球形、分散均匀。5.体外释放实验表明,在ph7.4的pbs中,载rap的plga和s100微粒24小时药物累积量为50%,而自组装rap/pnipam微粒同时间段的释放量为70%。体内药动学研究表明,自组装rap微粒组具有显著增加的口服生物利用度,其血药浓度-时间曲线下面积(auc)是plga和s100微粒的2倍。6.在ph7.4的pbs中,rap-np能够持续释放32天,且是要速率较为恒定;在小鼠体内,rap-np皮下注射后可持续释放22天,其血药浓度长时间维持在50ng/l。与此对应,小鼠皮下注射rap-np能够长时间保持主动脉组织中rap的浓度在1.2ng/g。7.rap/ac-bcdnp的释放具有明显的ph依赖性,其在ph5的释放速率显著快于ph7.4对应的释放速率。另一方面,pbs中加入1mmh2o2能够显著加速rap/ox-bcdnp的释药,表明其具有较好的氧化响应性。微酸性条件和h2o2的存在对rap/plganp的体外释放无明显影响。8.apoe-/-小鼠高脂喂养三个月后,对照组主动脉窦附近能够形成肉眼可见的白色斑块,表明as模型建立成功。与对照组相比,rap原料药能够明显抑制as斑块的生长,降低斑块内巨噬细胞和基质金属蛋白酶-9(mmp-9)的水平、升高斑块外周胶原含量,从而提高斑块稳定性。9.自组装rap/pnipam微粒口服给药后,在相同剂量下比plga和s100载药微粒能够更显著降低血液中炎症因子的水平、抑制as斑块生长,并增加斑块稳定性。10.与口服高剂量rap原料药相比,皮下注射高、低剂量的rap-np均能够更加有效地抑制as发展、减小斑块面积、降低斑块内坏死核面积、增加斑块稳定性。mtor信号通路检测结果表明,口服高剂量rap原料药能够同时显著抑制mtorc1和mtorc2,而rap-np能够选择性抑制mtorc1,因而后者具有更显著的抗炎和抗as作用。11.活体成像和共聚焦观察表明,apoe-/-小鼠腹腔注射后,cy5标记的ac-bcd纳米粒能够富集于as斑块,证明该类纳米粒可靶向至as斑块。体内药效学评价表明,响应性的rap/ac-bcdnp和rap/ox-bcdnp均比rap/plganp呈现出更加良好的治疗效果。12.与对照组相比,经口服、皮下注射和腹腔注射不同rap微粒系统干预后的小鼠,各时间点体重未见明显异常,小鼠主要脏器指数无显著差异,各项血液生化指标包括白细胞、血红蛋白、红细胞、血小板、尿素氮、肌酐、丙氨酸氨基转移酶和门冬氨酸氨基转移酶均无显著改变,且各主要脏器he切片未见明显病理变化。结论1.口服后,高剂量的rap原料药能够有效抑制apoe-/-小鼠as斑块的生长、提高斑块的稳定性,表现在主动脉斑块面积的减小、斑块内巨噬细胞和mmp-9水平的降低、以及斑块外周胶原含量的升高。2.通过含羧基小分子化合物介导的pnipam的自组装,可以制备rap载药微粒,实现rap的高效负载;同时因各分子间作用力大于药物分子结晶力,使得rap分子以无定形状态包裹于微粒中,因而具有良好的药物溶出度,口服给药后比对照微粒系统具有更高的生物利用度。与此对应,自组装rap微粒比同剂量的plga和s100微粒具有更有效的抗as作用。因此,自组装rap微粒有望为rap的临床应用提供一种理想的口服制剂。3.通过缩醛化反应成功制备了新型载体材料ac-bcd,采用水包油乳化法制备得到具备优越缓释性能的rap-np,它能维持血药浓度长时间稳定在较低水平,在这种药物作用方式下rap-np能够选择性抑制mtorc1;原料药因其较高的血药浓度能够同时抑制mtorc1和mtorc2信号通路。与口服rap原料药相比,rap-np缓释微粒具有更加优异的抗as作用。4.通过将氧化敏感性的基团化学键合于β-cd成功制备了新型氧化敏感性载体材料ox-bcd。通过纳米沉淀-自组装法制备可以制备具有不同响应性的rap载药纳米粒,其中rap/ac-bcdnp和rap/ox-bcdnp分别具有微酸性和氧化响应性释药性能。活体成像结果表明,腹腔注射后纳米粒能够靶向于主动脉斑块部位。与对照plga载药纳米粒相比,微环境响应性的rap/ac-bcd和rap/ox-bcd纳米释药系统具有显著增强的的抗AS作用。5.PNIPAm、Ac-bCD和Ox-bCD三种载体材料在一定给药途径下均具备良好的生物安全性。