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目的：根据人乙酰肝素酶(heparanase, HPA)的基因序列(cDNA)设计合成并筛选出有效的小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)。用siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,检测乙酰肝素酶的表达情况,以筛选出能够有效干扰乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达的siRNA片段。通过侵袭转移实验来检测siRNA的抗肿瘤侵袭转移作用,为研发抗肿瘤侵袭转移药物提供理论基础。另外,以壳聚糖为材料包裹siRNA,并偶联特异性的肿瘤细胞靶向分子叶酸,通过叶酸与细胞表面叶酸受体结合,提高siRNA的输送效率,实现安全有效的靶向性基因治疗。方法：委托上海吉码制药技术有限公司合成siRNA片段。用Lipo2000包裹不同浓度的带有荧光标记的FAM-siRNA转染MCF-7细胞,检测其转染效率把实验分为6组,实验重复3次。①阳性对照组(Positive control orβ-actin, PC);②阴性对照组(Negative control, NC);③siRNA片段Ⅰ；④siRNA片段Ⅱ；⑤siRNA片段Ⅲ；⑥control组。以lipo2000为载体,采用瞬时转染法转染MCF-7细胞,通过RT-PCR和Western Blot筛选出有效干扰乙酰肝素酶的mRNA及蛋白表达的siRNA片段。通过MTT法分别检测转染了24h、48h和72h后的MCF-7细胞的增殖情况。叶酸偶联壳聚糖,通过制备的叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,获得叶酸偶联壳聚糖(FA-CS);采用红外光谱法验证偶联是否成功,紫外分光光度法测定偶联比。然后用偶联了叶酸的壳聚糖与siRNA制备成FA-CS-siRNA纳米复合物。测定纳米复合物粒径和形态及其包封率转染：分别以control组、FA-CS组、FA-CS-siRNA纳米复合物组、CS-siRNA组和lipo2000-siRNA组进行转染,于48h提取总RNA通过RT-PCR检测其mRNA表达情况,于72h提取蛋白质通过Western Blot检测其乙酰肝素酶表达情况。肿瘤细胞侵袭实验分成lipo2000-siRNA组,FA-CS-siRNA纳米复合物组和阴性对照组。把转染后继续培养了24h的细胞接种于铺了Matrigel基质胶的培养小池中,继续培养24h后,显微镜下观察细胞穿膜情况,染色并计数。结果：1.不同浓度的FAM-siRNA转染MCF-7细胞,表现出不同的转染效率。当FAM-siRNA浓度为80nM/L和100nM/L时,转染效率比较高。2.3个siRNA片段都不同程度地下调乙酰肝素酶mRNA的表达,其中siRNA片段Ⅰ效果最明显。3.红外光谱确认叶酸已成功与壳聚糖偶联。4. FA-CS-siRNA纳米复合物的粒径为197.7nm,形态为圆型,分布较均匀。5. FA-CS-siRNA纳米复合物组能有效地干扰MCF-7细胞中乙酰肝素酶的表达。其干扰效率高于CS-siRNA组,接近于lipo2000-siRNA组。6.肿瘤细胞侵袭实验显示lipo2000-siRNA组和FA-CS-siRNA纳米复合物能有效抑制MCF-7细胞的侵袭和转移。结论：1.不同浓度组FAM-siRNA转染MCF-7细胞显示,80nM/L和100nM/L这两个浓度的转染效率比较好且结果很接近。因此后续实验采用80nM/L的siRNA作为转染浓度。2. siRNA片段Ⅰ能有效干扰MCF-7细胞乙酰肝素酶的表达,并有效地抑制了MCF-7细胞的侵袭和转移,因此选择siRNA片段Ⅰ用于后续实验。3.制备了粒径较小的FA-CS-siRNA纳米复合物,并可做为siRNA的传递载体有效转染MCF-7细胞。4. FA-CS-siRNA纳米复合物能有效干扰MCF-7细胞中乙酰肝素酶表达。其效率高于CS-siRNA组,接近于lipo2000-siRNA组。