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研究背景：急性白血病是造血系统的恶性增生性疾病,是一种造血干／祖细胞发生恶性变的异质性造血系统肿瘤,以异常造血细胞的恶性增殖、分化受阻、凋亡受抑并造成正常血细胞减少为特征,居我国儿童恶性肿瘤发病的首位。其中急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)约占儿童急性白血病的25-30%。除急性早幼粒细胞白血病外,其余各型虽化疗可使75%以上患儿获得临床缓解,但其5年无病存活率仍较低。因此寻找和探索治疗急性髓细胞白血病的新疗法,改善儿童髓细胞白血病患儿的预后,降低病死率,是全世界血液学工作者迫切需要解决的研究课题,也是当前我们儿科领域中的一项重要工作。近年来,随着细胞生物学和分子生物学等生命科学的发展,人们对白血病的认识越来越深入,对AML发生机制及治疗的研究已经深入到分子水平,研究者们发现AML细胞内存在基因缺陷或表达异常,同时也有生化和免疫学方面的改变。因此基于AML细胞与正常细胞在分子水平上的差异,如何利用AML的生物标志物,通过分子生物学技术在其早期诊断、治疗和判断预后上发挥更大的作用已经成为基础和临床研究的热点。自分泌运动因子受体(autocrine motility factor receptor, AMFR)是学者早年从鼠黑素瘤细胞中提取出的一种细胞表面糖蛋白,又名gp78,同时它又属于泛素蛋白酶体系统蛋白,其部分一级结构与肿瘤蛋白p53相似,与自分泌运动因子(autocrine motility factor, AMF)结合可促进细胞的迁移和运动。而且研究发现AMFR是以内质网(ER)环指结构为基础的泛素蛋白连接酶(E3),可通过调节内质网钙释放而阻止内质网应激效应及细胞凋亡,证实了AMFR是连接泛素化、ER降解以及肿瘤转移的潜在枢纽。AMF/AMFR在胃癌、肝癌、乳腺癌等多种恶性实体瘤中被关注,证实其与肿瘤的发生、转移和预后等密切相关。而AMFR作为泛素蛋白酶体系统蛋白,它在细胞增殖与细胞凋亡调控等方面的作用较少有人研究,在血液系统恶性肿瘤方面也鲜有人问津。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是近年来新兴的基因技术,它是指通过外界人为干预,将人工合成的与内源性mRNA特异性互补的双链RNA导入细胞,引起特定序列的nRNA降解,靶向抑制基因表达,从而达到基因治疗的目的,以其自身高效、特异、细胞毒性低等特点受到广大科学工作者的青睐。研究目的：本研究旨在探索AWFR在儿童急性白血病中是否存在异常表达,并通过特异性AMFR-siRNA转染AML细胞株,初步探索AMFR作为泛素蛋白酶体系统,对急性髓细胞白血病细胞株细胞周期和细胞凋亡等方面的影响及在AML中的作用机制。研究方法：1AMFR在儿童急性白血病中的表达检测收集初治急性白血病患儿及健康对照组新鲜骨髓标本,分为ALL组、AML组及健康对照组。培养AML细胞株THP-1、HL60和K562,并以健康人骨髓单个核细胞为对照。分别提取新鲜骨髓单个核细胞及各细胞株细胞中的总RNA,实时荧光定量PCR法扩增AMFR基因,检测(?)AMFR在急性白血病患儿原代骨髓细胞及AML细胞株中的相对表达量。2AMFR-siRNA转染THP-1细胞选择异常表达AMFR基因的急性单核细胞白血病细胞株THP-1,体外培养后,以处于指数生长期的细胞为实验对象,按说明转染AMFR-siRNA及无关对照siRNA(control-siRNA)。具体分组：①空白对照组,使用转染培养基处理细胞；②阴性对照组,无关阴性FICT荧光标记的control siRNA转染细胞；③实验组,采用特异性AMFR-siRNA转染THP-1细胞。实时荧光定量PCR法检测转染后各时间点每组细胞AMFR基因水平的表达；于最佳作用时间点检测Rock-2基因表达量、细胞周期及CyclinD1基因水平,以及Annexin V/PI法测细胞凋亡及凋亡调控基因Bcl-2表达。实验结果1AMFR急性白血病骨髓原代细胞水平及AML细胞株水平的表达相对定量RQ-PCR法对AMFR基因表达分析,发现AMFR在ALL、AML及健康患儿新鲜骨髓标本中相对表达量为4.02±1.77、2.93±1.28、0.99±0.05(x=16.852,p＜0.001),ALL组和AML组间比较差异有统计学意义(p=0.044),且都较健康对照组高(p＜0.001,p=0.003)。THP-1、HL60、K562细胞株及健康对照组中的相对表达量分别为4.34±1.01、3.91±0.73、2.94±0.59、0.98±0.05(x=28.0067,p＜0.001)。两两比较THP-1组和HL60组无差异(p=0.174)；THP-1组与K562组,HL60组与K562组差异有统计学意义p值分别为0.001、0.003。2AMFR-siRNA对THP-1细胞中AMFR基因干扰效应的检测RQ-PCR结果显示,AMFR-siRNA在转染后48小时开始起作用,72h时作用最明显,实验观察到96h,抑制效应已经明显减弱(F=261.333,p＜0.001)。72h control siRNA组和AMFR-siRNA组相对基因表达量分别为1.03±0.06、0.49±0.02(t=16.364,p=0.002)3AMFR-siRNA对THP-1细胞中Rock-2基因的影响于转染后72小时,测得AMFR-siRNA组ROCK-2mRNA相对表达水平为0.73±0.19,相对于congtrol siRNA组1.01±0.07,明显下调(t=4.212,p=0.002)。4AMFR-siRNA对THP-1细胞周期的影响流式细胞仪检测细胞周期,转染72小时后收获细胞,control siRNA组与空白对照组较转染前无明显差异,AMFR-siRNA组G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例明显下降,而G2/M期无明显差异。细胞周期蛋白CyclinDl mRNA表达水平也明显降低AMFR-siRNA组为0.63±0.13,control siRNA组为1.01±0.11(t=6.565,p＜0.001)。5AMFR-siRNA对THP-1细胞凋亡的影响转染72小时后,AMFR-siRNA组凋亡细胞占(19.58±4.29%),而空白对照组及阴性对照组凋亡细胞分别为(4.01±1.52)%、(3.88±1.43)%,实验组凋亡明显增加(p＜0.001)。AMFR-siRNA组Bcl-2mRNA表达水平0.67±0.15较control siRNA组0.99±0.06下调(t=6.129,p＜0.001)。结论本实验首次在儿童急性白血病骨髓原代细胞水平及细胞株水平证实了AMFR基因存在异常高表达,可能与急性白血病的发生、发展及预后不良有关。特异性AMFR-siRNA可以促进THP-1细胞凋亡,并阻止细胞的增殖。AMFR可能是急性髓细胞白血病基因治疗的潜在靶点。