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叠氮溴化乙锭(EMA)是一种核酸荧光染料,它具有与细胞外DNA、死亡细胞DNA或细胞膜受损细胞的DNA共价结合并抑制其发生PCR扩增反应,而对活菌细胞DNA扩增不产生影响的特点。因此将EMA与PCR技术相结合,可克服直接PCR方法无法区分死活菌的缺点,并避免假阳性试验结果。EMA与PCR技术相结合的技术已用于多种致病菌的检验,研究发现添加一定量的EMA不会对副溶血弧菌、肠弯曲杆菌、结合酵母、黏质沙雷氏菌等细菌的DNA扩增产生抑制作用,但会造成大肠杆菌0157：H7、金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、藤黄微球菌和远缘链球菌等细菌基因组DNA提取量不同程度的损失。此外,EMA是否会影响肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌活菌的DNA扩增未见相关报道。因此,本研究将EMA应用于鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的检测,探索EMA对肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌活菌DNA扩增的影响情况,建立一种只检测沙门氏菌活菌的方法。具体研究内容和试验结果如下：1. 肠炎沙门氏菌EMA PCR检测方法的建立本部分首先探讨了EMA对肠炎沙门氏菌DNA扩增的影响情况,然后用于死/活混合菌液的检测,以建立EMA PCR检测方法。结果发现：添加EMA至终浓度为50 μg/mL、曝光时间为10 min时,可抑制浓度为2.75×107 CFU/mL的肠炎沙门氏菌死菌的DNA扩增,且不会影响PCR方法检测肠炎沙门氏菌活菌的灵敏度,可有效避免假阳性试验结果。2. 鸡肉中活的鼠伤寒沙门氏菌和肠炎沙门氏菌的EMA RT-PCR检测方法的建立本部分使用EMA与RT-PCR联用的方法研究EMA处理对目标菌PCR反应的影响情况,然后将建立的EMA RT-PCR方法用于鸡肉中沙门氏菌的检测。结果发现：活菌添加EMA至终浓度为50 μg/mL时,其Ct值与未经EMA处理组的Ct值无显著性差异(P>0.05),死菌经EMA处理后其Ct值与活菌经EMA处理后的Ct值有显著性差异(P<0.05),而与阴性对照组无显著性差异(P>0.05),表明添加EMA不会影响活菌的DNA扩增。使用鼠伤寒沙门氏菌特异性引物建立的EMA RT-PCR方法用于鸡肉中鼠伤寒沙门氏菌的检测发现,与直接RT-PCR方法相比,EMA RT-PCR方法的检测结果更接近与平板计数结果(P>0.05)。相应地,使用肠炎沙门氏菌特异性引物建立的EMA RT-PCR方法用于鸡肉中肠炎沙门氏菌的检测其试验结果也与平板计数结果无显著性差异(P>0.05)。3.鸡肉中混合沙门氏菌EMA RT-PCR检测方法的建立本部分首先建立了沙门氏菌属通用引物建立了沙门氏菌的EMA RT-PCR检测方法,然后将其与第二部分建立的两种方法同时应用于鸡肉中混合沙门氏菌的检测。结果表明,当只添加一种引物进行RT-PCR时,使用通用引物建立的沙门氏菌EMA RT-PCR方法可以较准确地检出样品中活的沙门氏菌,其检测结果与与平板计数结果差异不显著(P>0.05)；使用鼠伤寒沙门氏菌特异性引物、肠炎沙门氏菌特异性引物分别建立的EMA RT-PCR方法,其对混合样品中鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的检出结果均与平板计数无显著性差异(P>0.05)。而检测活菌／死菌混合样品时,若同时添加3对引物进行RT-PCR,其对混合样品中沙门氏菌的总量、鼠伤寒沙门氏菌活菌含量、肠炎沙门氏菌活菌含量的检测结果与平板计数均有显著差异(P<0.05),准确度较差。后续研究可考虑优化RT-PCR反应体系或反应条件等参数提高方法的准确度。