新生血管性疾病(Neovascularization，NV)是当今很多眼科疾病导致视力灾难性丧失甚至致盲的主要原因。在正常视网膜血管的发育过程中，血管内皮细胞(Vascular endothelial cell，VEC)在各种细胞因子作用下增殖并通过细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)进行迁移有序的形成血管。而在病理性NV形成过程中，在眼的相关部位如虹膜、视网膜、及脉络膜可形成无序的，异常形态结构及无功能的血管形成。这些新生的血管很容易发生渗漏、出血、进而引起视网膜水肿、纤维增生、视网膜玻璃体出血或牵引性视网膜脱离可以导致潜在的灾难性的视力丧失。　　 本研究中，我们尝试探讨运用内源性血管抑制因子来治疗和抑制眼底NV并简要的讨论眼底NV的发生机制。我们着重研究了内源性血管生长抑制因子对于眼底NV的作用机制。内源性血管抑制因子，是一组机体自身存在的抑制血管生成的负反馈分子，对机体正常生理作用的干预和影响小。在研究中我们发明了一种新的免疫染色方法可以高质量定性和定量的评价视网膜新生血管(Retinal neovascularization,RNV)以及脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization，CNV)。本研究提供了几种眼底NV可行的新型治疗靶点，不仅可以作为有价值的研究工具，并且可能具备潜在的治疗前景。　　 1、One Click Staining一种特殊的新生血管特异性免疫组织化学染色以用于研究新生血管和巨噬细胞关系研究　　 目的:本研究的日的是研究和探索新的染色方法以提高及规范化视网膜血管和新生血管(NV)的染色，对新生血管更准确的进行定性定量分析。　　 方法:对缺氧诱导新生血管的小鼠，在出生后17天，对其视网膜表面产生的新生血管进行免疫组织化学染色，分别运用了荧光标记的GSA lectin抗体和没有荧光标记的抗体和不同长度的染色时间。与此同时，在缺氧诱导新生血管模型小鼠出生后的第13，15，17，19，21,23，25天进行全视网膜新生血管和巨噬细胞的体外染色，铺片拍照以观察新生血管和巨噬细胞的关系。同时对出生后21天rho/VEGF转基因小鼠采用同样体外染色方法，可以特异性地染色视网膜下血管。　　 结果:对缺氧诱导的小鼠新生血管模型（ROP模型）视网膜新生血管在用GSA标记的Lectin抗体染色40分钟后，可以观察到清晰的新生血管的细微结构包括新生血管前端的丝状足突，并且视网膜原有的结构血管没有或者仅有少量背景颜色，非常利于使用图像分析软件来定性和定量的评价新生血管。当以GSA标记的Lectin抗体和抗F4/80的抗体或者抗iNOS的抗体进行视网膜双重染色，结果发现iNOS在生长和退行过程中新生血管高表达，而在视网膜的其他部位则未见明显表达。而且可以显示巨噬细胞与新生血管的相关位置，进而揭示巨噬细胞和新生血管以及新生血管退化之间的关系。对缺氧诱导的小鼠新生血管模型，在不同的时点P13，P15，P17，P19，P21，P23以及P25天，运用这种染色方法观察到视网膜表面新生血管以及巨噬细胞分布，数量的明显变化。运用这种方法染色转基因RhoNEGF小鼠同样可以特异的染色出其视网膜下生长的新生血管。　　 结论:本研究描述的体外染色技术可以准确特异性地染色出新生血管。通过运用这种方法，视网膜新生血管的特异结构，得到了很好的染色显示。联合其他的抗体双染视网膜新生血管，进一步揭示了新生血管和各种其他炎性因子iNOS，以及巨噬细胞的相互关系。并且提供了简单的方法对巨噬细胞进行定义和精确计数，实验结果显示巨噬细胞和iNOS可能与眼内血管的形成和消退紧密相关。　　 2、内源性血管抑制因子rhEDI-8t抑制RNV和CNV　　 目的:本研究中，我们研究了重组血管内皮抑制因子rhEDI-8t，一种从来自胶原Ⅷ的内源性蛋白质，研究其对于在病理状态下产生的RNV、CNV的抑制作用。　　 方法:为了研究重组内源性血管生长抑制因子rhEDI-8t对于新生血管的抑制作用，实验分为体外实验和体内实验两大部分，在体外细胞学实验中我们通过培养人类脐血管内皮细胞(HUVEC)，观察血管内皮细胞增殖情况的增殖试验，和牛主动脉内皮细胞(BAEC)迁移能力的迁移实验。为了验证rhEDI-8t在眼新生血管上是否有抑制作用作用。我们进一步分别运用了三种不同机制的眼新生血管动物模型，包括了激光诱导的脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization CNV)的小鼠动物模型，5-6周大的C57BL/6雌性小鼠按照随机数字法随机双盲分为四组。对照组和只疗组分别予右眼眼内注入1μlPBS，或者1,2，5μg of rhEDI-8t(n=49，51，33，35;每个激光斑n=1)。第二天，使用激光光凝的方法在三个象限破坏小鼠的Bruch，s膜，并在两周后测量CNV面积。缺氧诱导的小鼠新生血管模型( ROP)，将出生7天的B6小鼠放入75％氧箱后5天，P12天的小鼠返回正常氧浓度并给予一眼内注射1μl1μg/μl rhEDI-8t，另一眼注入磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)作为对照。P17天，检测RNV平均面积。以及视网膜光感受器细胞表达VEGF的转基因动物模型(rho/VEGF mice)。rho/VEGF转基因小鼠在出生后第14天，同窝小鼠的右眼随机接受1μl(1μg/μl，n=10)endostatin或者1μl(1μg/μl，n=13) rhEDI-8t的眼内注射，而左眼则接受1μlPBS作为对照。7天后，即出生后第21天，rho/VEGF转基因小鼠麻醉后以FITC-Dextran做心腔灌注后作全视网膜铺片并用荧光显微镜镜检以及计数。　　 结果:内源性血管生长抑制因子rhEDI-8t在体外实验中，有效抑制了在bFGF刺激下人类脐血管内皮细胞的增殖和牛主动脉内皮细胞的迁徙。在几个体内新生血管动物实验模型中，眼内注射rhEDI-8t的实验组，不论对脉络膜新生血管的生成，视网膜新生血管，还是视网膜下新生血管都有明显的抑制作用，具有统计学差异。　　 结论:内源性血管生长抑制因子rhEDI-8t在体内和体外实验中都显示了有效的抗新生血管作用。它对于眼新生血管是有抑制作用的。这个研究提示rhEDI-8t可能成为一种可以有效与现有的针对VEGF的抗新生血管疗法结合，协同治疗进而在临床上起到更好更持久的抗新生血管作用。