[研究目的]脐带间充质干细胞因其来源充足、采集无创,并其增殖能力强无致瘤风险等诸多优势,逐渐成为间充质干细胞的主要来源,并已对多种免疫相关性疾病,如多发性硬化、系统性红斑狼疮、克罗恩病、移植物抗宿主病等取得了良好的临床治疗效果。树突状细胞虽非免疫效应性细胞,但由于其强大的抗原提呈作用和刺激T淋巴细胞增殖的能力,在自身免疫性疾病的发生发展中具有枢纽的作用。且脐带间充质干细胞对包括树突状细胞在内的多种免疫细胞具有明显的免疫抑制性,这对其治疗免疫相关性疾病提供了相应的理论依据。在本研究中,我们分离并鉴定了符合应用标准的脐带间充质干细胞,应用其干预树突状细胞的分化和成熟,对树突状细胞的功能和共培养上清中细胞因子的分泌进行了评估,并对其涉及的相关机理进行了探讨,为进一步理解脐带间充质干细胞治疗免疫性疾病的理论性提供科学证据。[实验方法]1.脐带间充质干细胞的分离、培养及验证1)脐带间充质干细胞的分离、培养组织贴壁法分离培养脐带间充质干细胞,分析细胞的生长曲线。2)脐带间充质干细胞表面标志的测定流式细胞术检测脐带间充质干细胞P6和P10代表面标记的表达。3)脐带间充质干细胞的诱导分化对P5代脐带间充质干细胞进行成骨、软骨和脂肪细胞的分化诱导。2.树突状细胞的诱导及鉴定使用CD14+磁珠从人PBMC中分离CD14+的单核细胞,再利用IL-4和GM-CSF诱导CD14+单核细胞向树突状细胞分化,并使用TNF-α诱导其成熟,通过流式细胞术比较CD14+单核细胞、未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞表面标志的差异。3.脐带间充质干细胞影响树突状细胞的分化和成熟1)脐带间充质干细胞与CD14+细胞共培养7天比较成熟树突状细胞形态学差异、表面标志的表达差异和刺激异体T淋巴细胞增殖能力的差异。2)脐带间充质干细胞与CD14+细胞共培养5天比较未成熟树突细胞形态学差异、表面标志的表达差异和吞噬抗原能力的差异,并进行细胞因子检测。3)脐带间充质干细胞与未成熟树突状细胞共培养2天比较树突状细胞表面标志的差异。[实验结果]1.脐带间充质干细胞的分离、培养及验证1)脐带间充质干细胞的分离、培养利用组织贴壁法成功分离并培养脐带间充质干细胞,增殖曲线表明脐带间充质干细胞在第5代细胞增殖明显,10代细胞以后细胞增殖减弱。2)脐带间充质干细胞表面标志的测定流式细胞术检测脐带间充质干细胞P6和P10代表面标记均高表达CD73、CD90和CD105,低表达CD45,CD34,CD11b,CD19和HLA-DR,无明显差异。3)脐带间充质干细胞的诱导分化对P5代脐带间充质干细胞成功进行了成骨、软骨和脂肪细胞的分化诱导。2.树突状细胞的诱导及鉴定成功诱导出未成熟树突状细胞(immature dendritic cells,iDCs)和成熟树突状细胞(mature dendritic cells,mDCs),iDCs 高表达 CD1a,mDCs 高表达CD1a 和 CD83。3.脐带间充质干细胞调节树突状细胞的分化和成熟1)在CD14+细胞诱导至成熟DCs细胞的期间,同时加入脐带间充质干细胞与之共培养7天;UC-MSCs干预组的成熟树突状细胞突触变短、CD1 a和CD83的表达下降,刺激异体T淋巴细胞增殖能力降低。2)在CD14+细胞诱导至未成熟DCs细胞的期间,同时加入脐带间充质干细胞与之共培养5天;UC-MSCs干预组的未成熟树突状细胞形态分化较慢,CD 1a的表达下降,吞噬抗原能力降低,培养上清细胞因子检测发现IL-6、IL-10、IL-1 β的分泌水平较高。3)在未成熟DCs诱导至成熟DCs细胞的期间,同时加入脐带间充质干细胞与之共培养2天;UC-MSCs与iDCs共培养2天并没有抑制DCs的成熟过程,反而有一定的促进作用。[研究结论]1.UC-MSCs在P5到P10代具有相对稳定的表面标志的表达和增殖能力。2.建立了 CD14+单核细胞分化为DCs的稳定的诱导方法。3.UC-MSCs显著抑制了 DCs的分化能力、抗原吞噬能力,以及抑制异体T淋巴细胞增殖能力;但并未对其成熟的过程产生抑制。4.UC-MSCs可能通过IL-6的分泌促使单核细胞产生IL-10,从而抑制单核细胞分化为树突状细胞。