虾肝肠胞虫PCR检测方法的建立及对凡纳滨对虾的感染研究

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虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)是一种专性细胞内寄生虫,主要寄生在对虾肝胰腺组织的肝小管上皮细胞中,成熟孢子多为椭圆形,大小约为0.9μm×1.8μm,属于微孢子虫科(Microsporidia)、肠胞虫属(Enterocytozoon)。EHP于2003年在泰国生长缓慢的斑节对虾(Penaeus monodon)中首次报道,2009年被成功分离并确定为孢子虫属的一个新物种。EHP宿主广泛,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、斑节对虾(P.monodon)和脊尾白虾(Palaemon carincauda)等虾类都是其主要感染对象,EHP感染致虾类患肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis,HPM)。虾类感染EHP后没有明显的病理特征,主要表现为生长速度缓慢甚至停止生长,个体大小差异明显。其不会导致虾类死亡,但感染严重时,经常伴随着各类对虾疾病。EHP给对虾养殖产业造成了很大的经济损失,目前已成为影响全球虾类养殖生产的重要病原之一。从2013年起,我国辽宁、天津、江苏、浙江和广东等多个省市的虾类养殖基地先后发现EHP的感染,部分地区的EHP阳性率甚至高达70%、80%以上,且呈逐年增长的趋势,EHP及其引发的感染病已经严重危害了我国虾类养殖产业。为详细研究EHP对凡纳滨对虾的感染,更加准确、快捷地检测EHP,本文建立了一种更灵敏、特异的EHP PCR检测方法,并且研究了EHP对凡纳滨对虾不同组织器官的感染情况,主要实验结果如下:1.建立了一种全新的EHP常规PCR检测方法,预期片段为358 bp,相比于之前的常规PCR方法(EHP 510和EHP 413),EHP 358具有更高的灵敏度和更好的特异性,最低可检测到20 copies的EHP DNA,且不与其他常见对虾病原发生交叉反应,适合应用于大量样品的检测。2.为调查EHP在山东地区的流行情况,从山东省不同地区采集了不同时期、不同大小和不同发育阶段的凡纳滨对虾样品,利用本研究建立的EHP常规PCR检测方法进行检测,结果表明山东省四个地区639只凡纳滨对虾样品EHP的阳性率为51.2%,部分地区例如烟台芝罘区、滨州市北海新区等的样品阳性率甚至高达70%以上,说明EHP在山东地区的传播、感染较为严重。3.通过人工投喂的方式研究了EHP对凡纳滨对虾不同器官的感染情况。证明了在较短时间(10天)内,EHP就能感染凡纳滨对虾,然后扩增至对虾体内的其他不同组织器官,且不同组织器官感染有所差异,其中中肠感染最为严重,EHP平均载量最高。该实验结果表明,凡纳滨对虾很容易通过摄食途径被EHP感染,EHP存在较大的水平传播风险,在对虾养殖生产中应加强防范。
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