研究背景类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种系统性自身免疫疾病,发病率约为0.5%～1%。临床表现主要为侵蚀性、对称性多关节炎,最终可能导致关节畸形和功能丧失,严重影响患者的生活质量。病理表现主要表现为滑膜炎症、血管增生(血管翳)、免疫细胞浸润和进行性关节破坏。滑膜成纤维细胞(Fibroblast-like Synoviocytes,FLS)的大量增生是RA特征性标志之一。随着病程的迁延,关节内逐渐出现免疫细胞浸润,不仅活化RA-FLS,而且促进IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌,导致骨骼的损害和关节软骨的破坏。近年来发现缺氧和氧化应激是RA的化学特征之一,而从缺氧角度探讨RA病理机制的研究并不多。RA滑膜中存在低氧环境,可诱导缺氧诱导因子(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-1)的产生。大量研究证明,HIF-1不仅促进葡萄糖转运蛋白表达升高,还增强细胞对葡萄糖的吸收。因此,低氧环境促进RA糖代谢活性増强。糖酵解是葡萄糖代谢的途径之一。一个葡萄糖分子可生成两分子丙酮酸和两分子三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)。有氧条件下,丙酮酸进入三(?)酸循环,释放更多能量;缺氧条件下,丙酮酸生成乳酸。为满足供能需求,RA滑膜组织中糖代谢从氧化磷酸化向糖酵解转变。随着RA病程加剧,RA关节内葡萄糖摄取量增加,糖酵解速率升高,为免疫细胞的增殖和效应细胞的活化提供能量。那么抑制糖酵解是否可以抑制RA的发展,从而达到治疗目的呢?我们课题组用葡萄糖代谢矩阵芯片(Glucose Metabolism RT2 ProfilerTM PCR Array)筛选RA的糖酵解关键基因,发现胶原诱导性关节炎(Collagen-induced Arthritis CIA)大鼠的滑膜组织中己糖激酶2(Hexokinase 2,HK2)、烯醇化酶(Enolase,ENO1)特异性高表达。课题组还用蛋白质组学通过比较了 RA、骨关节炎(Osteoarthritis,OA)及强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)患者的滑膜组织总蛋白谱,发现磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphateisomerase,TPI)在RA滑膜中特异性增高。HK2作为糖酵解的第一限速酶,参与糖酵解的第一步反应,该酶可将葡萄糖催化为6-磷酸葡萄糖,延续糖酵解反应。有研究发现HK2在RA滑膜中异常高表达并促进FLS的迁移、侵袭功能。因此,我们认为有效地抑制HK2可以达到抑制糖酵解的目的,从而达到治疗RA的目的。本研究选用HK2抑制剂2-脱氧葡萄糖(2-deoxyglucose,2-DG),观察2-DG是否对RA发挥治疗作用并探究其相关机制。2-DG是一种葡萄糖类似物,可与葡萄糖竞争性结合HK2,但其催化后生成的产物2-脱氧葡萄糖磷酸(2-deoxyglucose-phosphate,2-DG-P)不能继续进行糖酵解并竞争性抑制HK2的生成,从而阻断糖酵解代谢。目前2-DG已被广泛用于肿瘤研究,并证实2-DG可有效抑制肿瘤细胞糖酵解,减少ATP的合成。RA和肿瘤在病理方面有相似性,即它们的糖酵解活动性均增强,因此本课题计划研究2-DG是否对RA发挥治疗作用及相关机制。目前,只有少数研究发现2-DG可以抑制RA-FLS的增殖,但关于2-DG参与RA的调控机制尚不明确。本课题计划通过细胞学实验和动物实验这两方面探讨2-DG对RA的治疗效果及机制。mTOR(mammalian target of rapamycin)信号通路作为机体蛋白质合成的的调节枢纽,在多种癌症、自身炎症和自身免疫性疾病中异常活跃,并发挥调控癌细胞代谢的功能。研究证实,RA-FLS具有类似于肿瘤细胞的侵袭功能。mTOR通路在RA-FLS细胞中高表达并促进细胞侵袭,导致关节损害加重。mTOR的抑制剂可显著降低FLS的浸润、减少关节软骨的侵害,并显着降低疾病活动。在癌细胞中,增强的糖酵解可激活mTOR信号通路,进而促进癌细胞的生长。近年来的研究表明HK2的抑制剂可以通过靶向mTOR信号通路抑制肿瘤细胞的生长。但在RA中,糖酵解和HK2是否通过mTOR发挥作用仍然未知。本课题中,我们计划通过检测2-DG处理后的RA-FLS和CIA大鼠中mTOR的变化,探究糖酵解和HK2是否通过mTOR发挥作用。此外,我们拟通过检测2DG处理后的各种免疫细胞和细胞因子变化,探索糖酵解及mTOR对免疫的影响。为探究2-DG是否能够在细胞和动物水平上抑制糖酵解从而影响RA-FLS的生物学行为、炎性因子分泌以及相关机制,本研究设计为两部分。第一部分是细胞实验,收集临床RA患者滑膜组织标本,培养RA-FLS。用2-DG处理RA-FLS,体外观察2-DG对RA-FLS的增殖、凋亡、迁移、细胞因子分泌等作用。第二部分是动物实验,通过牛Ⅱ胶原诱导大鼠,构建RA经典动物模型CIA大鼠,观察2-DG是否具有治疗作用,并通过检测糖酵解关键酶的表达、mTOR信号通路的相关分子、免疫细胞、细胞因子分泌水平以进一步探究2-DG的作用机制。方法1.收集在山东大学附属千佛山医院接受膝关节置换手术的RA患者的滑膜标本10例,其中男性3例,女性7例,年龄区间39-80岁,平均年龄60岁,从滑膜组织中获取原代RA-FLS细胞并培养。2.为研究2-DG对RA-FLS细胞增殖的影响,将RA-FLS细胞依次分为2-DG(1、10、20 mM)处理组和对照组(等体积PBS),培养12 h、24 h和48 h,然后用CCK-8检测2-DG对细胞增殖能力的影响。3.为研究2-DG对RA-FLS细胞凋亡、迁移和细胞因子分泌的影响,将RA-FLS细胞依次分为2-DG处理组(1、10、20 mM)和对照组,并培养48 h。采用流式细胞术检测细胞的凋亡和炎性细胞因子,采用划痕实验及Transwell实验检测细胞的迁移。观察2-DG对RA-FLS细胞功能的影响。4.为研究2-DG对RA-FLS细胞糖酵解的影响,将RA-FLS细胞依次分为2-DG处理组(10、20 mM)和对照组,并培养48 h。采用Real-time PCR技术检测糖酵解相关酶基因己糖激酶 2(Hexokinase 2,HK2)、磷酸果糖激酶(Phosphofructokinase,PFK)、磷酸丙糖异构酶(Triose-phosphate isomerase 1,TPI1)、磷酸甘油酸激酶 1(Phosphoglycerate kinase 1,PGK1)、烯醇化酶 1(Enolase 1,ENO1)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PKM)、乳酸脱氢酶(Lactatedehydrogenase,LDH)的mRNA水平。采用Western blot验证HK2的蛋白表达水平。采用ELISA法检测ATP含量。观察2-DG对RA-FLS细胞糖酵解的影响。5.为研究2-DG对RA-FLS细胞mTOR信号通路的影响,将RA-FLS细胞依次分为对照组和2-DG处理组(10、20 mM),并培养48 h。采用Western blot检测哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,mTOR)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phos-phorylatedmTOR,p-mTOR)、磷酸化起始因子4E结合蛋白 1(Phos-phorylated eIF4E-binding protein 1,p-4EBP1)的蛋白水平。观察2-DG对RA-FLS细胞mTOR通路的影响。6.为研究2-DG对CIA大鼠的治疗作用,建立CIA大鼠作为RA的动物模型(n=20),并设立健康对照组(Normal Control,NC,n=10)。随机选取CIA大鼠(n=10),腹腔注射2-DG(5 mg/kg)进行治疗,作为2-DG治疗组。绘制随时间变化的关节炎临床评分曲线,同时采用HE组织化学法、X-ray评估病理变化。观察2-DG能否治疗CIA关节炎。7.为研究2-DG对CIA大鼠的糖酵解作用,采用Real-time PCR技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中糖酵解酶基因HK2、PFK、TPI1、PG1K1、ENO1、PKM、LDH 的 mRNA 水平;采用 Western blot 检测分析 NC 组、CIA 组、2-DG治疗组的滑膜组织中HK2蛋白:ELISA法检测滑膜组织中ATP含量的变化。观察2-DG对CIA大鼠体内糖酵解的影响。8.为研究2-DG对CIA大鼠mTOR信号通路的影响,采用Western blot检测NC组、CIA组、2-DG治疗组的滑膜组织中mTOR、p-mTOR和p-4EBP1的蛋白水平,观察2-DG对CIA大鼠体内mTOR通路的影响。9.为研究2-DG对CIA大鼠外周血免疫细胞的调节作用,采用流式细胞技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组中大鼠的B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、NK(Natural killer cell)和Treg(Regulatory cell)细胞在外周血中的比例变化,观察2-DG治疗前后淋巴细胞亚型的变化。10.为研究2-DG对CIA大鼠外周血细胞因子的影响,采用流式细胞技术检测NC组、CIA组、2-DG治疗组中大鼠的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和TNF-α的血清水平变化,观察2-DG治疗前后细胞因子的变化。结果1.CCK-8法检测2-DG对RA-FLS细胞增殖的影响。结果显示,相同时间段内,2-DG处理组(1、10、20mM)细胞增殖能力明显低于对照组(P<0.001)。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞的增殖。2.流式细胞术检测2-DG对RA-FLS细胞凋亡的影响。结果显示,2-DG(1、10、20 mM)处理的三个实验组,细胞的凋亡率都明显高于对照组(P1 mM=0.020,P10 mM<0.001,P20 mM<0.001)。说明2-DG可以促进RA-FLS细胞的凋亡。3.细胞迁移的功能由细胞划痕实验和Transwell实验共同验证。划痕实验结果显示,2-DG(1、10、20 mM)处理组的伤口愈合情况均显著低于对照组(P1mM<0.01,P10 mM<0.001,P20 mM<0.001)。Transwell实验结果显示,1 mM处理组无变化(P1 mM=0.070),10 mM和20mM处理组的细胞迁移能力明显弱于对照组(P10 mM<0.01,P20 mM<0.01)。以上结果说明2-DG抑制RA-FLS细胞的迁移。4.流式细胞技术检测2-DG处理组(1、10、20 mM)和对照组细胞培养上清液中细胞因子的变化水平。结果显示,与对照组相比,IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ 水平无变化(PIL-2=0.71,PIL-4=0.22,PIL-10=0.17,PIFN-γ=0.78),只有 IL-6(P1mM<0.05,P10mM<0.01,P20mM<0.01)和 TNF-α(P1mM=0.250,P10mM<0.01,P20mM<0.01)水平显著低于对照组。说明2-DG抑制RA-FLS细胞中IL-6和TNF-α的分泌。5.Real-time PCR检测 2-DG 对 RA-FLS 细胞中 HK2、PFK、TPI1、PGK1、ENO1、PKM、LDH的mRNA水平的影响。结果显示TPI1、PGK1、ENO1和LDH各组间无差异(PTP11=0.676,PPGK1=0.679,PENO1=0.788,PLDH=0.272)。与对照组相比,2-DG 处理组的 HK2(Pi0 mM=0.042,P20 mM=0.011)、PFK(P10 mM<0.001,P20 mM<0.001)、PKM(Pio mM<0.001,P20 mM<0.001)的mRNA水平显著降低。用 Western blot验证RA-FLA细胞中HK2的变化。结果显示,与对照组相比,2-DG处理组HK2的蛋白表达量显著降低(P10mM<0.01,P20 mM<0.01),细胞内ATP的产量也随之降低(P10mM=0.019,P20 mM<0.001)。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞中的糖酵解水平。6.Western blot 检测 2-DG(10、20 mM)对 RA-FLS 细胞 mTOR 通路变化。与对照组相比,2-DG处理组中p-4EBP1的活化水平显著上调(P10 mM<0.001,P20 mM<0.001),mTOR(P10mM<0.001,P20 mM<0.001)和 p-mTOR(P10Mm<0.001,P20 mM<0.001)的表达明显受抑。说明2-DG可抑制RA-FLS细胞中的mTOR信号通路。7.通过腹腔注射2-DG(5 mg/kg)治疗10次后,关节炎临床评分结果显示,CIA组的大鼠关节炎症状明显重于NC组(P<0.001)。2-DG治疗组的大鼠关节炎症状较CIA组缓解(P=0.004),但仍比NC组严重(P<0.01)。白光拍摄图片表观显示,NC组的大鼠关节无炎症表现;CIA组的大鼠踝关节肿胀,局部皮肤发红;2-DG治疗组的大鼠关节肿胀缓解,局部皮肤未见其他变化。HE染色结果显示,NC组、2-DG治疗组关节腔干净,骨轮廓清晰;CIA组骨质破坏,滑膜细胞大量增生和免疫细胞浸润。关节影像结果显示,NC组关节齐整,无骨侵蚀改变;CIA组关节结构错乱,骨侵蚀、骨破坏严重;2-DG治疗组关节面平整,骨侵蚀状况缓解。以上结果说明,2-DG对CIA大鼠关节具有治疗作用。8.通过2-DG治疗后,Real-time PCR检测各组滑膜组织HK2、PFK、TPI1、PGK1、ENO1、PKM、LDH的转录水平。结果显示TPI1、PGK1各组间无差异(PTPI1=0.187,PPGKI=0.1 10)。CIA组的大鼠滑膜组织中HK2、PFK、ENO1、PKM、LDH的mRNA水平均显著高于NC组,且均有统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001,P<0.001)。2-DG治疗组的大鼠滑膜组织中HK2、PFK、ENO1、PKM、LDH的mRNA水平都比CIA组明显降低(P<0.001,P=0.029,P<0.001,P<0.001,PM0.017)。2-DG治疗组中只有LDH基因的mRNA水平显著高于NC组(P<0.001),HK2、PFK、ENO1、PKM基因的mRNA水平与NC组无差异(P=0.930,P=0.105,P=0.054,P=0.717)。用Western blot验证HK2的蛋白水平。结果显示,CIA组的大鼠滑膜组织中HK2表达明显高于NC组(P=0.031),而2-DG治疗组HK2表达水平比CIA组显著降低(P=0.004),但与NC组相比无差异(P=0.197)。滑膜中的ATP产出水平也具有相同的趋势。CIA组的ATP表达显著高于NC组(P<0.001),而2-DG治疗组的ATP表达明显低于CIA组(P<0.001),但与NC组相比无显著变化(P=0.058)。说明2-DG可抑制CIA大鼠滑膜组织中的糖酵解水平。9.通过2-DG治疗后,Western blot检测大鼠滑膜组织中mTOR通路途径各蛋白的表达。结果如下,CIA组的大鼠滑膜组织中mTOR表达较NC组无明显变化(P=0.354);p-mTOR 较 NC 组表达明显升高(P=0.016);p-4EBP1 较 NC 组显著低表达(P<0.001)。2-DG治疗组的mTOR表达与CIA组(P=0.568)和NC组(P=0.076)相比均无明显变化;p-mTOR 比 CIA组明显低表达(P<0.001),但与NC组相比无差异(P=0.098);p-4EBP1则较CIA组显著表达升高(P=0.027),但还是低于NC组水平(P=0.021)。以上结果表明,2-DG对可抑制CIA大鼠的滑膜组织的m-TOR信号通路。10.通过2-DG治疗后,流式细胞技术结果显示CIA组外周血中B细胞高于NC(P=0.008)。2-DG治疗组与CIA组相比B细胞显著降低(P<0.001),但与NC组相比无差异(P=0.074)。CIA组的CD4+T细胞比例较NC组显著升高(P=0.009)。2-DG治疗组与CIA组相比CD4+T细胞显著降低(P<0.001),但与NC组相比无差异(P=0.109)。CIA组CD8+T细胞比例较NC组无变化(P=0.092)。2-DG治疗组的CD8+T细胞比例显著低于CIA组(P=0.014)和NC组(P<0.001)。CIA组的NK细胞比例相比于NC组无明显变化(P=0.091)。2-DG治疗组的NK细胞比CIA组(P<0.001)和NC组(P<0.001)显著降低。CIA组的Treg细胞比例明显低于NC组,且具有统计学差异(P<0.001)。2-DG治疗组的Treg细胞比例明显高于CIA组(P<0.001),但与NC组相比无差异(P=0.063)。以上结果说明2-DG治疗能抑制CIA大鼠的外周血中B、CD4+T、CD8+T及NK细胞水平,促进Treg细胞水平的升高。11.通过2-DG治疗后,大鼠细胞因子结果显示显示IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ在NC、CIA和2-DG治疗组这三组间无差异(PIL-2=0.188,PIL-4=0.077,PIL-10=0.1 1,PIFN-γ=0.067)。CIA 组的 IL-6(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)的血清水平均明显高于NC组,且具有统计学差异。2-DG治疗组的IL-6(P=0.011)、TNF-α(P=0.002)的血清水平均显著低于CIA组,但与NC组相比均无差异(P=0.751,P=0.689)。以上结果说明2-DG治疗能抑制CIA大鼠中IL-6和TNF-α的分泌。结论上述结果发现2-DG能够抑制RA-FLS和CIA大鼠滑膜中的糖酵解。2-DG通过抑制HK2、PFK、PKM的表达水平抑制糖酵解过程,导致ATP产量下降。2-DG抑制RA-FLS和CIA大鼠滑膜中的mTOR信号通路,促进RA-FLS细胞的凋亡,抑制其增殖和迁移,降低RA-FLS和CIA大鼠IL-6和TNF-α分泌水平。2-DG还降低CIA大鼠中B、T及NK细胞比例并升高Treg细胞。我们的结果建议糖酵解HK2抑制剂2-DG可以通过抑制关节滑膜细胞活化、抑制其mTOR信号活化、降低炎性免疫细胞比例和炎性细胞因子水平、提升Treg细胞比例实现对RA的治疗效应。HK2是潜在的RA治疗靶点。