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葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,简称GOD)广泛存在于微生物中,能够将葡萄糖氧化生成葡萄糖醛酸,广泛应用于食品,化工,医药等领域。实验室前期研究中从点青霉(Penicillium notatum)中成功克隆得到一个葡萄糖氧化酶基因,并在毕赤酵母(pichia pastoris)进行了异源表达,但是表达的水平偏低,达不到生产要求。本研究通过分析影响GOD基因在毕赤酵母中表达水平的因素,发现该基因中存在一些毕赤酵母的稀有密码子,这可能是该基因在毕赤酵母表达量偏低的原因。本研究根据毕赤酵母密码子使用的偏好性,并综合考虑GOD基因的GC含量和mRNA二级结构,对该葡萄糖氧化酶基因进行了密码子优化,在不改变GOD基因编码蛋白氨基酸序列的情况下,共改变了272个碱基,涉及96个氨基酸。人工合成了葡萄糖氧化酶基因(GOD-M),并将其克隆到表达载体pPIC9上,构建成为毕赤酵母重组表达质粒pPIC9-GOD-M,将重组质粒转化毕赤酵母表达菌株GS115,通过平板显色的筛选方法,筛选到15株表达水平较高的重组毕赤酵母菌株,其中GOD-M33#和GOD-M40#重组毕赤酵母表达量最高。经实验室3L发酵罐诱导产酶120 h后,酶活力达到最高,GOD-M33#和GOD-M40#重组子的发酵液上清酶活分别达到365U／ml和348U／ml,分别是同等情况下原始基因毕赤酵母重组菌株表达量的2.5和2.35倍。该酶的亚基分子量为67 kDa。酶促反应最适温度35℃,最适pH值为6.2。该酶具有较好的热稳定性和酸稳定性,50℃处理2 h后仍保留67%的酶活力,在pH4.0-7.0范围内酶活保持90%以上,在pH 3.0缓冲液中酶活力仍保留62%。在最适反应条件35℃,pH6.2时,该酶的Km值为83.21 m mol／L,Vmax为2170μmol／min/mg。该酶对各种常见的金属离子不敏感,但不耐受SDS,当酶促反应体系中存在1 mmol／L SDS时,酶活力只有对照(体系中无SDS)的40%左右。