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心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)已经成为西方发达国家乃至部分发展中国家人民健康的头号杀手。据世界心脏联盟分析预计,2020年全球CVD死亡率将增加50%,其CVD死亡人数将高达2500万人,其中1900万发生在发展中国家。降低CVD的患病率和死亡率已经成为各国卫生工作的重点。动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)是大部分CVD的病理基础,其发生发展过程包括血管壁的脂质沉积、白细胞浸润以及血管平滑肌的增生。目前研究已经证实AS是一种慢性炎症性疾病。由于AS慢性炎症发展过程中没有病原体的感染,因此也被称为“无菌性炎症”。越来越多的证据表明许多类型的“无菌性炎症”由炎症体介导。炎症体是固有免疫应答的重要组成部分,是一种多蛋白复合物,也称为“分子信号平台”(molecular signalling platform)。其中,NLRP3炎症体是研究最多,最具有代表性的炎症体,其“分子信号平台”包括NLRP3蛋白、一种酸溶性胶原蛋白(ASC)以及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase-1)。 NLRP3炎症体激活后,使caspase-1蛋白活化,从而诱导分泌促炎细胞因子,如白介素-1β (interleukin-1β, IL-1β)及白介素-18(interleukin-18, IL-18)。最近的研究表明,胆固醇结晶可以激活NLRP3炎症体并促进IL-1p的释放,提示NLRP3炎症体在AS的发生发展中起重要的作用。NLRP3炎症体激活后,可以产生IL-1p等促炎细胞因子。IL-1p在AS的始动环节发挥重要的作用,人体试验也发现与正常冠状动脉相比,AS斑块中IL-1β表达水平较高。对于低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor, LDLR)基因敲除的小鼠移植入NLRP3、ASC以及IL-1基因敲除小鼠的骨髓后,发现骨髓移植小鼠AS病变较对照组明显减轻。并且已经证实,载脂蛋白E (apolipoprotein E, ApoE)基因敲除小鼠同样对AS易感。然而,通过杂交的方法产生ApoE与NLRP3、ASC或caspase-1双基因敲除小鼠,并没有发现NLRP3炎症体的缺失对于AS的保护作用。炎症体在固有免疫中发挥重要作用,而AS被认为是一种无菌性慢性炎症疾病,由此可推论炎症体理应在AS的发生发展中起重要的促进作用。但是既往研究表明炎症体与AS的关系仍有一定的争议,还需要更多的研究探索二者的关系。鉴于此,本课题拟在下述两方面探索炎症体同AS的关联。一方面,探讨人的活体主动脉组织中NLRP3炎症体的表达是否与AS相关；另一方面,通过建立AS动物模型,探究基因干预NLRP3炎症体是否对AS进展造成影响。第一部分人活体主动脉中NLRP3炎症体表达的组织学研究目的：明确人活体主动脉组织NLRP3炎症体的表达量是否与AS病变严重程度相关,并且探索NLRP3炎症体表达量与AS危险因素的关系。材料方法：1.研究对象选择2011年3月至2012年12月在山东省千佛山医院行冠状动脉旁路移植术(coronary artery bypass graft, CABG)的36例患者作为研究组,其中男性25例,女性11例。对照组选取10例肾移植的供体者,所有供体者经入院查体均排除冠心病、高血压、糖尿病等器质性疾病。研究组患者留取CABG手术时废弃的主动脉壁打孔组织。对于对照组肾移植供体者,留取手术时废弃的肾动脉管壁组织。2.血生化分析所有研究组及对照组病例入院后均化验血浆总胆固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)、脂蛋白(a)[lipoprotein(a),Lp(a)]及甘油三酯(triglycerides, TG)等生化指标。3.冠状动脉造影检查所有研究组冠心病患者行CABG手术前均行冠状动脉造影检查(coronary angiography,CAG),以明确冠状动脉病变部位及程度。并且利用Gensini积分定量评估冠心病患者冠状动脉病变严重程度。4.免疫组化研究研究组主动脉及对照组肾动脉管壁组织经过固定、脱水、包埋后切片,随后石蜡切片脱蜡、修复抗原、加入单克隆小鼠抗人NLRP3抗体孵育、加入二抗后显色。利用图像分析软件检测NLRP3蛋白的表达量。结果：1.研究组患者与对照组供体基本情况研究组36例患者中,糖尿病(diabetes mellitus,DM)13例,高血压19例,心功能不全8例。10例肾移植供体者均无吸烟史,无冠心病、高血压病及糖尿病病史。研究组冠心病患者血浆TC、LDL-C、Lp(a)及TG水平较参考值显著升高,而血浆HDL-C水平较参考值显著降低(p<0.05)。对照组中,血浆TC、LDL-C、Lp(a)及TG水平较参考值无明显统计学差异(p>0.05)。2. Gensini评分通过CAG检查,得出每例研究组患者冠状动脉狭窄严重程度积分,即Gensini评分。所有研究组患者平均Gensini评分为84.31±23.78。3.动脉组织NLRP3蛋白表达情况研究组患者主动脉壁组织经免疫组化染色均有NLRP3表达,主要分布于血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的胞浆,表现为棕黄色或棕褐色。在对照组,肾动脉壁组织经染色显示NLRP3表达明显减少,着色呈无色或淡蓝色。经图像分析软件检测,两组NLRP3表达量相比有统计学差异(p<0.05)。4.研究组NLRP3表达量与血脂的关系研究组主动脉组织NLRP3表达量与血浆TC、LDL-C、HDL-C、Lp(a)及TG水平分别行相关性分析,结果表明NLRP3表达量与TC、TG、LDL-C及Lp(a)成正相关,r值分别为0.487、0.498、0.586及0.789,p<0.05。NLRP3表达量与血浆HDL-C水平成负相关,r-0.694,p<0.05。5.研究组NLRP3表达量与AS病变程度及危险因素的关系通过相关性分析,研究组NLRP3表达量与冠状动脉狭窄严重程度Gensini评分成正相关(r=0.673,p<0.05)。研究组患者NLRP3表达量在性别间比较,差异无统计学意义。而在吸烟者、高血压患者以及DM患者中,NLRP3表达量相比非吸烟者、非高血压患者及非DM患者明显增高,差异有统计学意义(p<0.05)。结论：1.本研究发现冠心病患者主动脉壁组织中NLRP3表达量相比正常对照组明显升高。2.本研究表明行CABG手术的冠心病患者主动脉壁组织中NLRP3表达量与冠状动脉狭窄严重程度以及AS主要危险因素成正相关。NLRP3可能通过调节AS主要危险因素在AS发生发展中起作用。第二部分NLRP3基因沉默对斑块易损性的影响及作用机制的研究目的：明确小鼠体内基因干预NLRP3炎症体后,是否会对AS产生保护作用,并且对其作用机制进行探讨。材料方法：1.慢病毒构建选择3条针对NLRP3的特定目标序列,合成双链DNA并且插入到线性载体当中。阳性克隆确定为慢病毒载体,其中pGCSIL/NLRP3-1(序列：5’-GGUGAAAUGUACUUAAAUC-3’)诱导出了最高水平的下游表达。pGCSIL/NLRP3-1以及病毒包装系统共转染293细胞来复制慢病毒。阴性对照载体(序列：5’-GUGCACAUGAGUGAGAUUU-3’)也经过包装,其序列为随机不相关序列。2.动物实验共40只8周龄雄性ApoE基因敲除小鼠接受全程高脂喂养,并被随机分为NLRP3基因沉默组及对照组。第4周,NLRP3基因沉默组小鼠经尾静脉注射NLRP3干扰病毒悬液,同时对照组小鼠接受注射阴性对照病毒悬液。第6周所有ApoE基因敲除小鼠经尾静脉重复注射病毒悬液。第8周后处死小鼠并分离主动脉,进行免疫组化、western blot及RT-PCR等分析。3.血脂测定处死小鼠前抽取静脉血,利用仪器测定两组小鼠血浆TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平,并进行对比。4. western blot检测利用western blot方法检测NLRP3基因沉默组及对照组主动脉组织NLRP3蛋白表达水平。5. caspase-1活性测定及促炎因子检测利用caspase-1比色测定工具包检测ApoE基因敲除小鼠主动脉组织中caspase-1的活性。利用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测小鼠主动脉组织中IL-1p和IL-18的含量。6.免疫组化分析主动脉根部组织经OCT冰冻切片包埋剂包埋后切片。组织切片进行HE染色、天狼猩红染色、油红O染色、VSMC a-actin染色及巨噬细胞MOMA-2染色。7. RT-PCR分析利用RT-PCR检测两组ApoE敲除小鼠主动脉组织中NLRP3、腺苷三磷酸结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)、腺苷三磷酸结合盒转运体G1(ATP-binding cassette transporter G1, ABCG1)、脯氨酸4羟化α1(prolyl-4-hydroxylase al, P4Hα1)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)及基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的mRNA表达水平。结果：1.慢病毒转染的安全性及有效性所有小鼠处死之前均处于健康状态,没有死亡发生。相比对照组,NLRP3基因沉默组小鼠主动脉组织中NLRP3mRNA及蛋白表达量明显减少,促炎因子IL-1β和IL-18(NLRP3炎症体的下游产物)含量同样减少(p<0.05)。并且,基因沉默NLRP3后,NLRP3炎症体的成分之一caspase-1的活性明显下降(p<0.05)。2.基因干预对斑块成分及稳定性的影响NLRP3基因沉默后,主动脉根部动脉粥样硬化斑块内VSMCs及胶原的含量相比对照组分别增加了39%及46%,而巨噬细胞数目以及脂质含量分别下降了22%及33%。通过计算,NLRP3基因干预后,易损指数明显下降(p<0.05)。3. NLRP3基因沉默对体重及脂质的影响NLRP3基因沉默组及对照组ApoE敲除小鼠体重及TC、TG、LDL-C及HDL-C的水平差异并无统计学意义(p>0.05)。4. NLRP3基因沉默对脂质及胶原代谢的影响相比对照组,基因沉默组小鼠主动脉组织中两种胆固醇流出调节蛋白,ABCA1及ABCG1的mRNA表达水平明显升高(p<0.05)。同时,经NLRP3沉默后,胶原合成限速酶P4Hα1的含量明显升高,而两种胶原溶解酶MMP-2及MMP-9的含量明显较少(p<0.05)。结论：1.通过RNA干扰技术构建的针对小鼠NLRP3基因的慢病毒转染是安全及有效的。2.ApoE基因敲除小鼠经NLRP3基因沉默干预后能够明显减少动脉粥样硬化斑块的体积并且提高斑块的稳定性,其作用可能是通过影响脂质及胶原的代谢来实现的。