皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,c SCC)是一种起源于表皮、皮肤附属器、以及复层扁平上皮角质形成细胞的恶性肿瘤,发病占皮肤恶性肿瘤的16%,仅次于基底细胞癌,光线性角化病、鲍温病及角化棘皮瘤均能导致角质形成细胞的恶性增殖。c SCC具有侵袭性,可发生早期转移。因此,鳞状细胞癌的高转移、易侵袭性是威胁全球人民的公共健康问题,进一步研究皮肤鳞癌侵袭机制,转移以及增值的分子机制,具有重要的价值和深远的意义。Rab23是小GTP酶Rab超家族成员,具有明显的细胞内囊泡转运功能。本课题组前期研究发现,Rab23在鳞癌中高表达,且与鳞癌分化负相关;Transwell实验证实Rab23显著促进鳞癌细胞侵袭,并调控侵袭关键分子Rac1的表达。但Rab23促进鳞癌细胞侵袭的机制尚不清楚。本研究拟以皮肤鳞状细胞癌为研究对象,从临床标本、细胞水平和动物实验三方面,分别观察Rab23与Rac1在鳞癌中表达的相关性,明确Rac1在Rab23促进鳞癌侵袭中的关键作用,探讨Rab23调控Rac1的作用机制,确认Rac1受Rab23调控后促进鳞癌侵袭的效应分子,为全面阐明Rab23促进鳞癌侵袭作用的分子机制奠定基础。实验方法:一、稳转细胞株的建立及鉴定慢病毒感染建立稳定表达不同形式Rab23的Sa3鳞癌细胞株;Western blotting检测Rab23、Rac1在稳定表达不同形式Rab23的Sa3鳞癌细胞株中的表达。二、Rab23促进鳞癌侵袭,并依赖其GTP酶活性1.细胞实验:Transwell侵袭实验-检测表达不同形式Rab23的皮肤鳞癌细胞侵袭力的不同及影响;划痕实验-检测表达不同形式Rab23的鳞癌细胞迁移力的不同及影响;2.动物实验:裸鼠荷瘤实验在体观察Rab23是否促进鳞癌细胞侵袭。三、Rac1在Rab23促鳞癌侵袭中起关键作用1.免疫组化检测Rab23、Rac1在皮肤鳞状细胞癌及正常皮肤中的表达,统计分析Rab23、Rac1的阳性表达,分析二者相关性;2.激光共聚焦检测Rab23与Rac1在鳞癌细胞中的表达;3.干涉Rac1之后检测表达不同形式Rab23的鳞癌细胞株侵袭力及迁移力的变化;4.激光共聚焦检测Rab23与整合素α5β1的关系;干涉α亚单位后检测表达不同形式Rab23的鳞癌细胞株侵袭力及迁移力的变化。实验结果:1.Rab23在表达不同形式Rab23的鳞癌细胞中的表达:Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L中高表达,在Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi中低表达,说明Sa3-Rab23不同表达细胞株建系成功;Rac1在表达不同形式Rab23的鳞癌细胞中的表达:Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L中高表达,在Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi中低表达。2.Transwell实验检测Rab23对Sa3鳞癌细胞侵袭力的影响:细胞侵袭能力为Sa3-Rab23-Q68L>Sa3-Rab23-wt>Sa3-Rab23-S23N>Sa3-Rab23-RNAi.3.细胞划痕实验检测Rab23对Sa3鳞癌细胞迁移能力的影响:细胞迁移能力为Sa3-Rab23-Q68L>Sa3-Rab23-wt>Sa3-Rab23-S23N>Sa3-Rab23-RNAi.4.裸鼠荷瘤实验结果示:Sa3-Rab23-Q68L组小鼠皮下注射1周后注射部位皮下形成直径约0.6cm3大小结节,Sa3-Rab23-S23N、Sa3-Rab23-RNAi各组未成瘤。5.Rab23、Rac1在皮肤鳞状细胞癌中阳性表达,且在中低分化鳞癌中阳性表达程度较高;Rab23、Rac1在正常皮肤中不表达;Rab23与Rac1的表达正相关。6.激光共聚焦观察结果显示:Sa3-Rab23-wt、Sa3-Rab23-Q68L细胞株Rab23在包膜上高表达,且Rac1、α5β1整合素在包膜处与Rab23共定位。7.不同方式干涉Rac1后Transwell、细胞划痕实验检测Sa3鳞癌细胞侵袭能力、迁移能力的影响:Sa3细胞系行Rac1-inhibitor后,各株细胞侵袭能力、迁移能力均明显下降;Sac3细胞系行干涉Rac1表达后,细胞侵袭能力、迁移能力与对照组相比均下降。8.干涉α5β1整合素的α亚单位后Transwell、细胞划痕实验检测Sa3鳞癌细胞侵袭能力的影响:Sa3细胞系行α5β1整合素的α亚单位敲除后,细胞侵袭能力与对照组相比均下降。主要结论:1.Rab23、Rac1在皮肤鳞癌中高表达,且Rab23与Rac1的表达正相关,说明Rab23可能在皮肤鳞癌中正调控Rac1的表达。2.Rab23高表达可以促进Sa3鳞癌细胞的侵袭和迁移,并且其可能是通过调控Rac1促进侵袭和转移的。3.Rab23调控Rac1是可能是通过调控α5β1整合素完成的。