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研究目的抑郁症是糖尿病的并发症之一。至今全世界约有三分之一的糖尿病的患者伴有抑郁,但糖尿病抑郁症的具体机制尚未得到阐明。已有证据表明NLRP3炎性小体的激活参与抑郁症和糖尿病心肌病等相关的病理过程。而糖尿病抑郁症发病机制中是否伴随有NLRP3炎性小体的激活还未可知。运动作为一种安全有效的干预方式,对糖尿病和抑郁症都有一定的治疗效果。但运动能否延缓糖尿病抑郁的病理过程还有待进一步的探究。本论文的主要目的是探究NLRP3炎性小体在糖尿病抑郁的过程中所发挥的作用及其具体下游机制,进一步探究运动锻炼是否能够改善糖尿病抑郁症。研究方法第一部分实验方法本论文的第一部分在整体水平上采用STZ诱导I型糖尿病模型,建型时间为4周。4周后,（1）对野生型和NLRP3敲除的糖尿病小鼠进行行为学检测;（2）应用Western Blot、Elisa等方法检测小鼠海马组织中NLRP3炎性小体相关蛋白、凋亡和焦亡相关蛋白因子的表达;（3）用免疫荧光组化等技术观察神经元凋亡蛋白的原位共染情况;（4）用TUNEL试剂盒检测小鼠海马组织的细胞凋亡情况。在细胞水平上:采用高糖培养海马神经元细胞HT22模型,（1）应用Western Blot、Elisa等方法检测HT22细胞中NLRP3炎性小体相关蛋白、凋亡和焦亡相关蛋白因子的表达;（2）用TUNEL试剂盒检测HT22细胞的凋亡情况。此部分主要探究NLRP3炎性小体的激活及其下游通路在糖尿病抑郁过程中的作用。第二部分实验方法本论文的第二部分我们将在上述模型的基础上对糖尿病小鼠进行跑台运动训练和外源性补充NaHS两种干预。模型周期结束后,（1）对运动干预和NaHS干预的糖尿病小鼠进行行为学检测;（2）用Western Blot等实验方法检测运动干预的糖尿病小鼠海马中炎症/IDO通路的相关因子和H2S相关酶的表达,以及NaHS干预的糖尿病小鼠海马中IDO的表达情况。在细胞水平上:用Western Blot的实验方法检测NaHS干预后神经胶质细胞中的IDO表达情况。探究运动是否是通过恢复H2S的表达改善糖尿病抑郁样行为。研究结果第一部分糖尿病引起的大脑海马区炎症对抑郁样行为影响及其作用机制一、糖尿病诱导抑郁并伴随有NLRP3炎性小体的激活1、STZ诱导糖尿病小鼠出现抑郁样行为成功构建STZ诱导的I型糖尿病模型,模型时间为4周。4周后检测糖尿病小鼠的抑郁样行为。与对照组相比,糖尿病组小鼠矿场实验中的中心距离、中心/外周距离、中心时间、中心/外周时间和穿越中心的次数减少,而在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间延长。2、糖尿病诱导抑郁过程中伴随有NLRP3炎性小体的激活Western检测糖尿病小鼠海马中NLRP3炎性小体的表达情况,糖尿病小鼠海马中的NLRP3、caspase1表达增多。同时Elisa结果显示,糖尿病小鼠海马中的IL-1β和IL-18表达增多。3、高糖诱导HT22细胞NLRP3炎性小体表达增多Western检测高糖处理的HT22细胞中NLRP3炎性小体的表达情况,随着高糖处理的浓度增加,NLRP3、caspase1表达呈依赖型的增多。同时Elisa结果显示,IL-1β和IL-18表达也呈浓度依赖性的增多。二、高糖通过氧化应激诱导海马神经元中的NLRP3炎性小体激活1、高糖使得ROS表达增多在整体水平,用尾静脉注射二氢乙锭的方法检测糖尿病小鼠海马中的ROS生成情况;在细胞水平,用荧光探针2,7-二氯荧光素二乙酸酯检测神经元细胞内ROS水平。结果显示,与对照组相比,高糖组的ROS阳性结果表达增多。2、高糖通过氧化应激激活海马神经元NLRP3炎性小体用氧化应激清除剂处理细胞,Western检测HT22细胞中NLRP3炎性小体的表达情况。与高糖组相比,HG+NAC组细胞中的NLRP3、caspase1表达明显降低,同时IL-1β、IL-18表达也减少,这就表明高糖通过氧化应激诱导NLRP3炎性小体的激活。三、NLRP3基因敲除可逆转STZ所诱导的糖尿病小鼠海马内焦亡/凋亡水平的增加1、糖尿病小鼠海马中的凋亡和焦亡水平增加Western检测p53、Bax、Puma等相关凋亡蛋白和GSDMD等焦亡蛋白。糖尿病小鼠海马中的焦亡和凋亡蛋白表达增多。同时用免疫荧光方法检测神经元标记蛋白NeuN和凋亡效应蛋白cleaved caspase3原位共染的情况,糖尿病小鼠海马切片中共染表达增多。用TUNEL试剂盒检测海马组织中DNA断裂的情况,结果显示,糖尿病小鼠的TUNEL阳性细胞显著增多。2、NLRP3基因敲除后可缓解糖尿病小鼠海马中的焦亡和凋亡引入NLRP3基因敲除的小鼠,在上一部分的基础上我们检测NLRP3基因敲除后糖尿病小鼠海马中凋亡和焦亡的情况。结果表明,与糖尿病组比,糖尿病+NLRP3-/-组促凋亡相关蛋白的表达下降,NeuN和cleaved caspase3原位共染减少,同时TUNEL染色的阳性细胞明显减少,GSDMD N的表达也明显下降。四、高糖以NLRP3依赖的方式诱导海马神经元细胞HT22发生凋亡/焦亡1、高糖诱导海马神经元细胞发生焦亡和凋亡Western和Elisa检测p53、Bax、Puma、GSDMD等相关凋亡和焦亡蛋白以及IL-1β、IL-18和LDH的表达量,高糖组中的焦亡和凋亡蛋白表达增多。同时,TUNEL试剂盒检测海马神经元中DNA断裂的情况,结果显示,高糖组神经元中的TUNEL阳性细胞显著增多。2、、NLRP3抑制剂可逆转高糖所诱导的焦亡和凋亡我们用NLRP3抑制剂MCC950处理海马神经元细胞,高糖处理48h后收集细胞。Western和Elisa结果显示,MCC950+高糖组凋亡和焦亡相关蛋白表达明显降低,IL-18,IL-1β和LDH的释放量也明显的减少。同时,TUNEL阳性细胞数量减少。3、、NLRP3干扰可逆转高糖所诱导的焦亡和凋亡为了进一步探究NLRP3在高糖所诱导的焦亡和凋亡中作用,用NLRP3siRNA处理细胞,干扰效率大约为70%左右。Western和Elisa结果显示,NLRP3siRNA+高糖组凋亡和焦亡相关蛋白表达明显降低,IL-18,IL-1β和LDH的释放量也明显的减少。同时,TUNEL阳性细胞数量减少。以上的结果表明,NLRP3炎性小体在高糖诱导海马神经元细胞焦亡和凋亡中发挥着重要的作用。五、NLRP3基因敲除后可缓解糖尿病并发的抑郁样行为对野生型小鼠和NLRP3敲除小鼠注射STZ,造模成功4周后检测行为学。与糖尿病组相比,NLRP3-/-+糖尿病组小鼠在TST和FST中的不动时间明显减少,在矿场实验中的中心距离、中心/外周距离、中心时间、中心/外周时间和穿越中心的次数显著增加。第二部分运动锻炼对糖尿病抑郁样行为的影响及其作用机制一、运动锻炼改善STZ所诱导的糖尿病抑郁样行为构建运动干预STZ诱导的I型糖尿病的小鼠模型,模型时间为4周。4周后检测四组小鼠的抑郁样行为。糖尿病+运动组小鼠在矿场实验中的中心距离、中心/外周距离、中心时间、中心/外周时间和穿越中心的次数增加,而在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间减少。二、运动锻炼抑制STZ诱导糖尿病小鼠海马中NLRP3/IDO通路的激活Western检测糖尿病小鼠海马中IDO和运动后小鼠海马中的NLRP3和IDO的表达情况。发现,糖尿病小鼠海马中的IDO表达增多而糖尿病+运动组的NLRP3、IDO表达明显降低。这就提示,运动锻炼抑制糖尿病抑郁过程中中NLRP3/IDO通路的激活。三、运动锻炼改善STZ诱导糖尿病小鼠海马中的H2S相关酶的表达1、STZ诱导糖尿病小鼠海马中的H2S相关酶表达的减少Western检测糖尿病小鼠海马中的CBS表达,糖尿病组小鼠海马中的CBS表达减少。2、运动锻炼改善STZ诱导糖尿病小鼠海马中的H2S相关酶的表达Western检测运动后糖尿病小鼠海马中的CBS表达,与糖尿病组相比,糖尿病+运动组小鼠海马中的CBS表达增加。四、外源性H2S补充缓解STZ诱导的糖尿病抑郁样行为构建H2S干预STZ诱导的I型糖尿病的小鼠模型,模型时间为4周。4周后检测四组小鼠的抑郁样行为。结果显示,与糖尿病组相比,糖尿病+H2S组小鼠在矿场实验中的中心距离、中心/外周距离、中心时间、中心/外周时间和穿越中心的次数增加,而在强迫游泳实验和悬尾实验中的不动时间减少。五、外源性H2S补充缓解高糖所诱导的IDO表达增多Western检测小鼠海马中的IDO表达情况,发现糖尿病+H2S组的IDO表达下降。同样,在细胞水平上,我们用不同浓度的NaHS处理高唐培养的神经胶质细胞,发现随NaHS浓度的增加,IDO表达呈浓度依赖性的减少。结论STZ诱导的I型糖尿病通过氧化应激使得海马中的NLRP3炎性小体激活,进而导致海马神经元发生焦亡和凋亡,从而诱导个体出现抑郁样的行为表现。运动,作为一种干预方式,可通过恢复H2S的表达,抑制炎症/IDO通路,从而起到延缓糖尿病抑郁病理过程的作用。