先天性巨结肠又称赫什朋病（Hirschsprung’s disease，HD or HSCR)或无神经节细胞巨结肠症（aganglionic megacolon）。该病是受累肠段粘膜下和肌间神经丛副交感神经节细胞缺失，导致病变结肠持续痉挛收缩，肠内容物排出受阻为特征的一种先天性肠道动力障碍性疾病~[1]。在活产儿中发病率约为1/5000~[2]，是小儿外科常见疾病，占消化道畸形的第二位。Cajal间质细胞(interstitial cells of Cajal，ICC)是一种广泛分布于整个消化道的特殊间质细胞，被认为是平滑肌自发性、节律性电活动，即“基本电节律”(又称“慢波”)的起搏细胞，与胃肠动力密切相关[3,4]。近年，越来越多学者认识到HD患儿肠运动功能障碍与ICC分布、数量及功能异常有关~[5,6]。而ICC的特异性受体c-kit与其配体干细胞生长因子（stem cell factor，SCF）所组成的SCF/c-kit信号系统决定了ICC分化命运与功能的正常发挥，SCF/c-kit信号系统可能介导了ICC在HD疾病发生发展中的作用。因此，研究SCF/c-kit信号系统与HD疾病的相关性，有助于进一步研究导致HD发生发展的分子机制，对于深入理解HD的发病机理具有重要的理论意义。本研究拟在构建不同类型乳鼠巨结肠模型的基础上，探索SCF/c-kit信号系统的改变与HD疾病的相关性，为进一步研究SCF/c-kit发生变化后如何引起HD功能改变的相关机制奠定理论和实验基础。实验目的建立不同类型无神经节细胞巨结肠的乳鼠实验动物模型，探索SCF/c-kit信号系统的改变与HD的相关性。实验方法实验一：不同类型无神经节细胞巨结肠乳鼠实验动物模型的建立与鉴定将出生6～8日龄SD乳鼠4窝(每窝10只)随机分为4组（实验组3组及对照组1组）。采用经肛门置入不同长度的导管，推注不同剂量、不同浓度苯扎氯铵（benzalkonium chloride，BAC）的方法建立短段型（置入0.5cm，0.5%BAC灌注10μl）、常见型（置入1cm，0.2%BAC灌注20μl）、长段型（置入1.5cm，0.1%BAC灌注50μl）三种类型无神经节细胞巨结肠动物模型。分别于处理后2、4、6、8周在各组取1只实验动物处死后观察肠段大体形态，取全段结肠及直肠，固定、包埋、切片后行苏木素-伊红染色；通过免疫组织化学染色检测神经元特异表达的蛋白基因产物9.5（PGP9.5）表达情况，鉴定模型建立成功与否并结合大体形态学观察确定病变累及肠管的范围。实验二：HD动物模型组织水平SCF、c-kit表达量的研究选用短段型组HD模型动物处理后肠组织与相应部位对照组肠段，脱水、包埋、冰冻切片后通过免疫荧光技术检测各组c-kit和SCF在实验处理后不同时间点的表达情况；通过Western-blot、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）从蛋白和基因水平明确狭窄肠段与对照组相应部位肠段c-kit和SCF在实验处理后不同时间点的表达情况。实验三：HD动物模型ICC的原代培及干预后SCF、c-kit表达量的研究新鲜分离HD模型动物狭窄段和对照组相应部位的肠组织，剪碎消化后制成单细胞悬液，将细胞悬液以每孔1x10~6的细胞密度接种于6孔板。实验共分为四组，未实施药物干预的组别为HD组和正常对照（NC）组，实施激动c-kit受体而上调干细胞生长因子SCF（简称S）和用Glivec（简称G）阻断c-kit受体的干预组分别为HD+S组、HD+S+G组。上调SCF：细胞接种于培养板24小时后，第一次换液时在培养液中加入SCF（100ng/ml），以后隔天换液并加入SCF（100ng/ml），培养9天，即HD+S组。阻断c-kit：细胞在含SCF的培养液中培养7天后，换成含Glivec（10μM）的培养液，每24小时换液，培养48小时，即HD+S+G组。HD组和NC组：细胞接种于培养板后24小时进行第一次换液，以后隔天换液，培养9天。通过免疫荧光技术观察各组ICC的形态学变化；对实验中的四组细胞进行ICC的流式分选后，通过Western-blot、RT-qPCR从蛋白和基因水平明确干预后ICC中c-kit和SCF的表达情况。结果1.与对照相比，在推注不同浓度、不同剂量的BAC后2、4、6、8周实验组大鼠逐渐出现腹胀，粪便颗粒变小，处理段肠管出现狭窄，狭窄近端粪便潴留；病理组织学结果显示随着造模时间的延长实验组动物狭窄段肠组织神经节细胞的分布出现逐渐减少的趋势，且不同实验处理方法造成病变累及的肠段明显不同。2.与正常对照相比，免疫荧光检测发现c-kit和SCF在HD模型动物肠狭窄段的表达随造模时间的延长逐渐减少，同时c-kit、SCF蛋白和mRNA的表达也出现一致减少的趋势。3.各组原代培养的ICC在形态上有明显差异，这种差异主要表现在细胞突起的长度上。与正常对照组ICC相比，HD组ICC突起较短或未见；加入SCF后的HD+S组ICC突起较HD组明显增长；而加入Glivec后的HD+S+G组ICC突起较HD+S组变短。4.在细胞水平，c-kit、SCF蛋白和基因二者表达趋势基本一致，即与正常对照ICC中的表达量相比，其他各实验组两目标分子的表达均减少（P<0.05）；各实验组间比较则有HD+S+G组较HD+S组低，但较HD组高（P<0.05）。结论1.经肛门灌注不同浓度、不同剂量BAC的方法成功建立了短段型、常见型、长段型三种类型无神经节细胞巨结肠症的乳鼠实验动物模型，该方法建立的模型稳定、可重复性好，为深入先天性巨结肠发病机制提供了可靠的动物模型。2.对模型动物病变肠段ICC的特异性受体c-kit及其配体SCF的表达进行检测，以及对模型动物结肠组织ICC进行原代培养并实施干预后，发现SCF/c-kit信号系统和HD的改变相关，为进一步研究HD疾病状态下该信号系统如何引起ICC的改变打下坚实基础。