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毕赤酵母具有真核蛋白表达高效、基因操作容易和可高密度培养等优势,已成为重要的外源蛋白表达平台。虽然以pAOX为启动子的甲醇型毕赤酵母是最常用的毕赤酵母表达系统,但甲醇的易燃易爆特性和毒性限制了它的大规模工业化应用。本实验室在前期工作中成功构建了以pGAP为启动子的毕赤酵母表达系统,在以葡萄糖为唯一碳源的培养过程中实现了外源蛋白的表达。为了全面深入了解外源蛋白的表达对以葡萄糖为唯一碳源的毕赤酵母的生理代谢的影响,本文采用13C代谢流分析技术,研究了不同的外源蛋白表达水平对毕赤酵母生理代谢的影响。13C代谢流分析是能精确获取菌体胞内代谢通量的可靠方法。标记底物的高价格使小容量的摇瓶成为最常用的标记实验反应器,但摇瓶培养过程难于测控,氧传递效率低,限制了其在毕赤酵母13C代谢流分析中的应用。基于过程缩小原理,本文开发了一套250mL微型反应器系统,可对培养过程的各种参数进行精确的测量和控制。同时,该反应器系统具有较高的氧传递效率,可满足毕赤酵母培养的高耗氧需求。以毕赤酵母GS115为出发菌株,使用具有不同启动效率的组成型启动子,分别构建了p-半乳糖苷酶的高表达菌株G1HL和低表达菌株GHL。在以葡萄糖为唯一碳源的培养基上,对两株菌株进行培养,比较了它们的胞外宏观代谢特性。结果表明,G1HL的比生长速率、葡萄糖比消耗速率和副产物的比生成速率明显降低。与此相反,G1HL的相对呼吸速率以及生物量得率有明显提高。在250mL微型反应器系统上,对两株菌株的胞内微观代谢进行了分析。结果表明,G1HL的糖酵解途径和戊糖磷酸途径的氧化分支途径的通量明显提升,同时TCA循环的通量也有一定的提升。通过对两株菌的能量代谢及还原力代谢进行进一步分析发现,外源蛋白的高表达增加了菌体对ATP和NADPH的需求,为满足这种需求,G1HL对代谢通量进行了重新分配。同时,我们发现两株菌的TCA循环通量远小于野生菌株的上限,表明了毕赤酵母GS115具有同化更多碳源,使其进入TCA循环产生更多能量以满足更高水平外源蛋白需求的潜在能力。本文从代谢通量水平上掌握了毕赤酵母GS115在以葡萄糖为唯一碳源时对外源蛋白高表达的响应特征,在此基础上提出了有可能进一步提高外源蛋白表达水平的菌株改造和工艺优化策略,对利用毕赤酵母安全高效地表达外源蛋白具有重要的指导意义。