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研究目的:全反式维甲酸(ATRA)是第一个成功应用于白血病治疗的诱导分化药物,能够通过降解PML-RARα融合蛋白特异性诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化成熟,因此已成为临床上治疗APL的首选药物。但至今为止,ATRA诱导细胞分化的作用机制仍未得到系统阐述。根据现有文献报道,维甲酸诱导基因G(RIG-G)可与COP9信号复合体(CSN)亚基CSN5相互作用,导致CSN复合物破坏并抑制其功能,提示CSN可能参与ATRA诱导的细胞分化;但是,其相关性研究仍未见报道。因此,本研究将重点研究CSN在ATRA诱导APL细胞分化过程中的作用,并探讨其可能的作用机制。具体研究内容分为三个部分:1)阐明CSN在ATRA诱导APL细胞分化过程中的变化情况;2)研究ATRA诱导分化中CSN-CRLs信号通路的变化;3)探讨CSN-CRLs信号通路调控PML-RARα自噬降解的分子机制。研究方法:1)选用人白血病细胞株NB4细胞为研究对象,以ATRA处理来考察ATRA诱导细胞分化过程中CSN的表达情况:应用吉姆萨染色观察细胞形态学改变;细胞经CD11b抗体孵育后采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达;应用RT-PCR检测细胞中CSN各亚基m RNA水平变化;应用Western blot检测CSN蛋白水平的变化。同时应用RT-PCR检测11例APL初诊患者和15例非血液疾病患者骨髓细胞中CSN3和CSN5的表达情况。2)选用人白血病细胞株NB4细胞为研究对象,采用Western blot检测ATRA诱导细胞分化过程中CSN-CRLs信号通路中CRLs支架蛋白cullin蛋白、底物识别蛋白及下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等的表达情况。3)选用人白血病细胞株NB4细胞为研究对象,应用Western blot和免疫荧光法检测ATRA诱导分化中细胞内自噬水平变化;选用293T细胞为瞬时表达宿主,共转染DAPK1和PML-RARα,通过Western blot检测分析DAPK1对PML-RARα蛋白的影响;分别以蛋白酶体抑制剂MG132和自噬抑制剂3-MA处理细胞进一步比较观察PML-RARα蛋白表达情况。研究结果:1)吉姆萨染色结果表明ATRA作用72小时后,NB4细胞分化为成熟粒细胞。同时,经流式细胞术检测细胞分化特异性抗原CD11b的表达,结果显示ATRA能够诱导NB4细胞发生分化,且呈时间依赖性变化。Western blot及RT-PCR等检测结果显示,ATRA作用后,CSN复合物及各亚基表达水平均明显下调,且与细胞分化进程相一致。此外,通过RT-PCR对临床患者进行检测,结果发现CSN3和CSN5在APL患者骨髓中的含量明显高于非白血病患者;经ATRA化疗缓解后,APL患者的CSN3和CSN5的m RNA表达水平均明显下降。进一步提示ATRA可以抑制CSN复合物的表达。2)鉴于CSN复合物在泛素蛋白酶体调节中的重要作用,进一步检测CSN-CRLs信号通路中相关蛋白的变化。Western blot检测结果显示,ATRA作用后,NB4细胞中CRLs支架蛋白cullin1和cullin3蛋白及其底物识别蛋白Skp2、βTr CP与KLHL20的表达都显著下降;同时,其下游靶蛋白DEPTOR、p27与DAPK1表达明显上调。这些结果表明CSN-CRLs-E3信号通路可能在APL发病以及ATRA诱导分化中发挥重要作用。3)由于DEPTOR、DAPK1等蛋白分子在细胞自噬调控中发挥着重要作用,而研究发现分化诱导剂ATRA可以增强APL细胞的自噬水平,并能促进PML/RARα蛋白降解。为了探讨DAPK1等蛋白的累积是否与ATRA诱导的PML/RARα蛋白的自噬降解有关,采用脂质体共转染PML/RARα和DAPK1至293T细胞,通过Western blot检测,结果显示DAPK1的过表达可促进PML/RARα蛋白的降解以及增强细胞自噬;在加入自噬抑制剂3-MA后,细胞自噬水平下降,同时DAPK1介导的PML/RARα蛋白降解作用明显减弱,提示DAPK1可以促进PML/RARα蛋白的降解,很可能与其介导的细胞自噬有关。结论:通过本课题的研究,首先,我们发现CSN在APL患者及NB4细胞株中呈高表达;而在ATRA作用后CSN的表达水平明显下调。其次,ATRA通过调节CSN-CRLs信号通路导致其下游靶蛋白DEPTOR、DAPK1等表达增加,而DAPK1可以促进PML/RARα融合蛋白的自噬降解。本研究较系统地探讨了CSN在ATRA诱导APL细胞分化中的作用及其相关机制,为进一步完善与发现新的诱导治疗方案提供了实验理论依据。