近年来,癌症的死亡率已经成为了诸多国家中死亡之首。在过去的十年里尽管手术和放化疗技术取得显著进展但癌症的预后还是很不理想,仍存在着疗效不显著,毒副作用大等不足。肿瘤的预后与肿瘤转移密切相关,肿瘤转移过程非常复杂,是临床上最难攻克的堡垒之一,大约90%的恶性肿瘤患者死于转移,因而抑制肿瘤转移的研究是极为重要的医学课题。本课题组长期研究环境应答基因JWA与恶性肿瘤发生发展关系,发现JWA表达缺陷的黑色素瘤细胞其迁移、侵袭、粘附能力都明显高于对照细胞。回顾性的人黑色素瘤和胃癌队列研究结果显示:较癌旁正常组织而言,癌组织中JWA显著低表达;且癌组织中JWA的低表达增加了淋巴转移和远处转移的几率;与高表达JWA的患者相比,癌组织中低表达JWA者预后不良。小分子化合物作为近些年的研究热点,被广泛的运用于抑制肿瘤的研究中。本课题组的研究以立足于从小分子化合物库筛选JWA基因激动剂为基础,利用荧光素酶报告基因检测系统,从中筛选出能够明显激活JWA基因表达的小分子化合物,并对其抗癌效果进行验证,筛选出明显抑制肿瘤细胞迁移和转移的小分子化合物。本研究旨在为研发激活JWA基因表达的小分子化合物的抗癌效应提供科学依据。目的:筛选出明显激活JWA基因表达的小分子化合物。初步探究小分子化合物抑制肿瘤细胞迁移和转移的功能。方法:构建带有新霉素抗性的JWA启动子报告基因质粒,利用荧光素酶检测系统,筛选能够特异性激活JWA启动子表达的化合物。利用蛋白质免疫印迹验证所得的化合物可以激活JWA基因的蛋白表达水平。CCK8实验检测小分子化合物对细胞活性的影响。小分子化合物处理胃癌细胞HGC-27后,用穿孔小室迁移观察对胃癌细胞迁移能力的影响。体内实验选择黑色素瘤尾静脉注射被动转移模型并用小分子化合物干预,通过观察肺组织黑色素瘤转移灶数目和小鼠存活时间来检测小分子化合物在体内抑制肿瘤迁移中的效果。结果:1.利用分子生物学方法,成功构建带有新霉素抗性的JWA启动子报告基因质粒pGL3-JWA-neo,经测序验证构建质粒的正确性;HBE细胞稳定转染重组质粒,建立激活JWA基因药物筛选细胞模型。2.利用荧光素酶检测系统对小分子化合物库中40000个化合物进行药物筛选,筛选荧光值>x+3s,能够显著激活JWA启动子的化合物;结合分子量大小,脂水分配系数,化合物结构式等,从65个具有剂量效应关系的小分子化合物中选择8个进行进一步研究。3.Western Blot验证所合成的化合物处理细胞24h可以明显激活细胞内的JWA蛋白的表达,浓度为0.IμM时就能发挥作用。4.体外研究发现激活JWA表达的小分子化合物没有明显细胞毒性产生。通过CCK8实验,对细胞的增殖能力进行了检测,发现小分子化合物处理细胞12h,24h,48h和72h,细胞未出现明显的抑制生长作用。5.体外研究小分子化合物对胃癌细胞迁移的影响。穿孔小室迁移实验证明,小分子化合物JAC-3,JAC-4,JAC-6,JAC-7和JAC-8处理胃癌细胞HGC-27后,细胞的迁移能力减弱,选取5个典型视野进行拍照计数,统计结果显示P<0.05,同时Western Blot观察到JWA蛋白表达升高,FAK表达降低。6.体内研究筛选抑制小鼠肿瘤转移的小分子化合物。在小鼠黑色素瘤被动转移模型中发现JAC-6干预小鼠肺组织中黑色素瘤转移灶明显少于对照组小鼠。同时观察到JAC-1,JAC-3,JAC-4和JAC-6可激活小鼠肺组织内JWA的表达。在小鼠黑色素瘤生存模型中,生存期分析显示饲喂JAC-4的小鼠平均生存期为24d,生存率明显高于对照组(P<0.01),生命延长率为10.34%。结论:本研究采用一系列细胞和分子生物学方法和技术,筛选出多个可以激活JWA基因表达的小分子化合物。通过细胞模型对化合物进行初步验证,发现可以抑制肿瘤细胞迁移;运用动物模型进一步深入研究,小分子化合物可以抑制黑色素瘤细胞被动转移,并显著延长小鼠存活时间。这些发现为研究以JWA为靶点的抑制肿瘤转移治疗手段提供了新的方向,有重要的潜在应用前景。