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目的:动脉粥样硬化(AS)是缺血性卒中的重要病因。炎症,尤其是NLRP3炎性小体参与了动脉粥样硬化斑块形成的核心过程,增强自噬可以抑制动脉粥样硬化的发生发展,二者之间的相互作用近年来受到广泛关注。近期有研究显示NLRP3炎性小体可以被自噬降解,这一过程伴有炎性小体组成蛋白的泛素化修饰。但是动脉粥样硬化中两者的关系及泛素化在两者衔接中的作用及相关机制尚不明确。本研究主要有以下目标:1、验证ox-LDLs对泡沫细胞中炎症和自噬的影响;2、验证泡沫细胞中自噬和炎症的关系;3、探索自噬是通过影响哪些炎症相关蛋白调节NLRP3炎性小体功能;4、确定在自噬精确识这些炎症相关蛋白过程中起作用的泛素链。方法:1、用ox-LDLs干预THP-1来源的巨噬细胞建立泡沫细胞模型。在泡沫细胞模型中,给与时间梯度和浓度梯度的ox-LDLs刺激,应用Western blot和ELISA方法,检测NLRP3炎性小体及自噬相关蛋白表达水平,观察ox-LDLs对NLRP3炎症和自噬的影响;2、应用雷帕霉素和3-MA上调或下调泡沫细胞中自噬水平,观察炎症水平及NLRP3炎性小体相关蛋白表达变化;3、对泡沫细胞转染p62-siRNA,观察敲低p62表达对NLRP3炎症的影响;对用雷帕霉素上调自噬的泡沫细胞转染p62-siRNA,应用Western blot和ELISA方法,检测NLRP3炎性小体相关蛋白表达水平,验证p62在自噬和炎症中的作用;4、用免疫共沉淀的方法,检测和p62结合的炎性小体相关蛋白;5、用免疫共沉淀的方法,检测敲低p62表达后,NLRP3炎性小体相关蛋白的泛素化修饰变化,确定p62识别的主要泛素链;6、用特异性去泛素化酶预处理p62和NLRP3炎性小体相关蛋白复合体,观察和p62结合的炎性蛋白的量的变化,验证该泛素链在p62和炎性蛋白衔接中的作用。结果:用ox-LDLs干预THP-1来源的巨噬细胞后,通过油红O染色可以见到明显的细胞内脂滴形成,形成泡沫细胞。Ox-LDLs时间和浓度梯度实验显示:ox-LDLs以时间和浓度依赖性促进caspase-1(p20)和IL-1β表达,这一过程中伴有NLRP3、pro-IL-1β表达上调,而ASC、pro-caspase-1的表达不受影响。同时,ox-LDLs以时间和浓度依赖性抑制LC3II/LC3I的比率、提高p62的表达。用雷帕霉素和3-MA上调或下调自噬,可以分别使caspase-1(p20)和IL-1β的表达下调或上调,这一过程中,伴有NLRP3和ASC表达的变化,而pro-caspase-1和pro-IL-1β的表达不受影响。用p62-siRNA敲低p62水平后,p20、IL-1β、NLRP3、ASC的表达增加;敲低用雷帕霉素上调自噬细胞的p62水平后,p20、IL-1β、NLRP3、ASC的表达水平没有因为上调自噬而下降。免疫共沉淀发现,NLRP3、ASC、p62三者结合,但NLRP3和ASC形成稳定的蛋白复合体,用ASC抗体免疫沉淀时脱落的p62比用NLRP3抗体沉淀时多。免疫共沉淀发现NLRP3和ASC上均发生K48/K63两种泛素化修饰,敲低p62后,NLRP3上的K63泛素链明显增加,K48泛素链增加不明显,而ASC上的两种泛素链修饰均未发生变化。用K63特异性去泛素化水解酶AMSH处理NLRP3-p62蛋白复合体后,发现与对照组相比,p62结合的NLRP3减少。结论:我们的研究表明:1、Ox-LDLs可以呈时间和浓度依赖性激活泡沫细胞中NLRP3炎性小体,并抑制自噬,这从侧面加重炎症反应;2、通过增强自噬可以抑制泡沫细胞中NLRP3炎性小体的激活,进而减轻炎症;并且自噬可能是通过降解NLRP3和ASC蛋白,而不是pro-caspase-1和pro-IL-1β实现对炎症的调节;3、自噬通过接头蛋白p62识别NLRP3上的K63泛素链,识别并绑定NLRP3炎性小体,将其导入自噬泡进行降解。