目的： 化学疗法作为神经胶质瘤的术后辅助性治疗，被认为有助于提高患者生存率。Tamoxifen(TAM，他莫昔芬)作为抗肿瘤药物，广泛应用于雌激素受体(estrogenreceptor，ER)阳性的乳腺癌的治疗，近年来研究发现，TAM也能用于ER阴性的肿瘤化疗，其中包括神经胶质瘤，但其作用机制并不十分清楚。 本课题应用TAM处理大鼠C6神经胶质瘤细胞(C6细胞)，观察处理过程中PKCa、ERK、JNK等蛋白磷酸化水平的变化，探讨PKCα/MAPK信号的激活在TAM导致C6细胞凋亡过程中所起的作用，为临床联合应用相关信号抑制剂与TAM治疗神经胶质瘤提供一定的实验室依据。 方法： 1.新生SD大鼠星形胶质细胞的培养、鉴定：解剖显微镜下分离SD大鼠大脑皮质，剪碎组织，0.25％胰酶消化；消化下来的细胞贴壁培养7～10d后，置于37℃恒温摇床，250rpm摇15～18h，去除脱落细胞，继续贴壁培养，待细胞生长至90％融合时胰酶消化传代； 2.C6大鼠神经胶质瘤细胞的培养、传代，及生物学特性研究：C6细胞在正常培养条件下以含10％FBS的DMED培养基培养，至90％融合时用胰酶消化，调节细胞密度为(3～5)×105/ml传代；以细胞计数法分别计数接种0～8d的细胞数，并绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间； 3.以免疫荧光的方法检测C6细胞与正常大鼠星形胶质细胞中GFAP、Map2、Nestin及PKCCα的表达情况； 4.不同浓度TAM(10～30μM)处理静息状态的C6细胞(接种次日换用无血清培养基饥饿24h的细胞)经不同时间点(0～60min)，通过WesternBlot的方法观察细胞中PKCα、ERK、JNK等磷酸化水平的变化；通过台盼蓝拒染法、DAPI染色、DNAladder、FACS等方法观察TAM对C6细胞凋亡的影响； 5.体外培养的静息状态的C6细胞分别给予PKCα、ERK、JNK的特异性抑制剂预处理，再加入TAM，通过WesternBlot方法观察细胞PKCα、ERK、JNK等磷酸化水平的变化；通过细胞计数、FACS等方法同步观察在各种不同抑制剂与TAM的共同作用下对C6细胞凋亡的影响。 结果： 1.体外培养的大鼠星形胶质细胞贴壁生长，胞体较大，有多条突起；经机械振荡纯化的胶质细胞，免疫荧光显示为GFAP强阳性，Map2和Nestin阴性，PKCα弱阳性； 2.普通培养条件下的C6细胞贴壁生长，胞体较小，少见双核或多核，核浆比大，有多条细长突起；体外培养的C6细胞7天以内均呈对数生长，细胞群体倍增时间为(19.67±0.63)h；免疫荧光显示，C6细胞GFAP阳性，不表达Map2和Nestin；与体外培养的大鼠星形胶质细胞比较，C6胶质瘤细胞中PKCα强阳性表达，定位于胞浆和突起； 3.TAM可激活C6细胞PKCα，在30μMTAM作用时间为15min时PKCα磷酸化水平明显升高，并随TAM作用时间的延长而增加，一直持续至1h： 4.TAM还可激活C6细胞ERK、JNK等激酶，二者的磷酸化均在TAM作用时间为15min形成峰值，随即迅速下降，而后又稍有回升； 5.TAM可引起C6细胞死亡，与TAM浓度及作用时间正相关；SPSS软件计算出其IC50值为(29.05±2.18)μM；TAM所致的C6细胞死亡以凋亡为主，表现为：①核形态的改变，荧光镜下可观察到核固缩，染色质深染，聚集成团等典型的凋亡细胞核征象；②琼脂糖凝胶电泳可检测出凋亡细胞特有的DNA阶梯状片段，呈TAM浓度和时间依赖性；③PI染色后经FACS能检测到细胞凋亡所形成的亚二倍体凋亡峰，其峰值随TAM作用时间的延长或TAM浓度的增加而增加； 6.PKCα的特异性抑制剂Go6976能部分抑制TAM作用过程中ERK、JNK的磷酸化增加；并增强TAM促进C6细胞凋亡的作用：当5，10，20，30μMTAM单独作用时，C6细胞凋亡率分别为(4.56±3.95)％，(4.26±3.42)％；(30.03±11.00)％，(56.10±11.24)％，当Go6976与各浓度TAM联合作用时，细胞凋亡率分别升高至(28.52±7.81)％，(49.30±8.42)％，(63.53±13.65)％，(69.22±8.61)％： 7.ERK抑制剂PD98059和JNK抑制剂SP600125对于TAM所致的PKCα磷酸化水平增加并无明显影响，但也能抑制TAM作用过程中ERK、JNK的磷酸化增加，同时增强TAM促进C6细胞凋亡的作用，当PD98059与各浓度TAM联合应用时，细胞凋亡率分别为(13.52±8.26)％，(19.68±8.94)％，(37.66±9.40)％，(70.80±9.09)％；当SP600125与各浓度TAM联合应用时细胞凋亡率分别为(12.50±8.86)％，(25.00±10.67)％，(47.78±8.92)％，(74.67±9.55)％。 结论： 1.体外传代培养的大鼠C6神经胶质瘤细胞贴壁生长，且生长迅速；保持胶质细胞源性，不表达具有干细胞特性的Nestin或者神经元特性的Map2：与体外培养的正常星形胶质细胞相比，C6细胞胞浆中PKCα强阳性表达； 2.TAM在诱导C6细胞凋亡的同时，也能激活细胞PKCα/MAPK信号，此信号通路的激活在细胞信号发生改变的早期阶段起保护细胞、抑制凋亡的作用。