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为明确lnc RNA MALAT1与mi RNA181b的相关性,采用计算机生物学软件通过“碱基互补的原则”进行位点的预测,将预测出的位点克隆至双荧光素酶报告基因进一步验证;位点经验证确认后则进一步研究两者表达的相关性。此外,mi RNA181b可与(葡萄糖调节蛋白)GRP78的靶基因m RNA-3’UTR结合从而调节GRP78的表达,通过改变lnc RNA MALAT1与mi RNA181b的浓度检测GRP78的表达水平,明确两者的调控关系。否则调整实验方向。目前研究血管新生的细胞主要有人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及微血管内皮细胞(MVEC),本实验选择的是小鼠脑微血管内皮细胞(b End3),主要原因是:细胞培养简单,对培养基无特殊要求;其增值迅速,对血管因子敏感;来源小鼠,离体和在体实验相衔接。大量研究证明:缺血性脑卒中后VEGF、TNF-α、ANG-I等因子大量增加,并促进了血管新生;因此,实验设计使用一种或多种缺血性脑卒中后的因子,模拟脑卒中后高浓度因子环境,刺激目标细胞,在观察细胞增殖迁移的基础上检测lnc RNA MALAT1及mi RNA181b的表达,同时利用氧-糖剥夺(oxygen-glucose Deprivation,OGD)致目标细胞的缺血模型,检测二者的表达变化;最后通过改变二者表达水平刺激目标细胞,检测细胞的增殖、迁移、相关促血管生成因子的变化。在促血管生成因子的研究中,VEGF研究最为透彻,其家族成员VEGFA与血管新生最为紧密。VEGFA与VEGFR2结合激活两条信号通路:激活Src信号通路后,导致内皮细胞上α6β1整合素与其配体分离,进一步激活金属基质蛋白酶(MMPs,主要是MMP2、MMP9),降解细胞外基质,促进内皮细胞的迁移;其次,激活经典的PI3/AKT信号通路,释放钙离子、PKC等第二信使促进内皮细胞活化、分裂、增殖,促进血管新生。其中AKT、P-AKT则是PI3/AKT信号通路的核心蛋白。由于实验检测目标中包括了VEGF,因此VEGF不能作为刺激因子;此外,ANG-I必须与其受体结合才能发挥作用,但其受体只存在于受损的内皮细胞表面。目前相关文献报道使用TNF-α刺激HUVEC观察细胞增殖迁移及mi RNA表达,结合实验室条件及实验经费,实验选择TNF-α作为刺激因子进行实验。相关实验检测指标及方法如下:血管新生:细胞增殖(MTT法)、细胞迁移(Transwell法);过表达mi RNA181b(mi RNA 181b mimics)、抑制mi RNA181b(mi RNA 181b inhibitor);过表达lnc RNA MALAT1(质粒)、抑制lnc RNA MALAT1(si RNA或si MALAT1);q-PCR检测VEGFA、MMP2、MMP9;免疫印迹法检测VEGF、AKT/P-AKT、GRP78。第一部分Lnc RNA MALAT1与mi RNA181b位点的预测及表达水平相关性的检测研究目的:明确lnc RNA MALAT1、mi RNA181b之间是否存在结合位点及两者的调控关系。研究方法:首先通过mi RNA及lnc RNA生物数据库查找lnc RNA MALAT1、mi RNA181b的碱基序列;通过计算机生物软件‘RNA 22 version 2.0’预测lnc RNA MALAT1、mi RNA181b之间是否存在结合位点;如果存在,则将预测出的位点克隆至双荧光素酶报告基因进一步确认位点的可靠性。最后,通过mi RNA181b mimics/inhibitor、si MALAT1转染细胞检测lnc RNA MALAT1及mi RNA181b、GRP78(HSP A5)的表达水平,明确二者的调控关系。研究结果:计算机预测小鼠lnc RNA MALAT1与mi RNA181b之间存在两个结合位点,位点最左侧分别位于lnc RNA MALAT1序列的2211、5124位置;双荧光素酶报告基因系统检测发现小鼠mi RNA181b能够降低该荧光素酶的表达;mi RNA181b mimics抑制lnc RNA MALAT1、GRP78的表达;mi RNA181b inhibitor促进lnc RNA MALAT1、GRP78的表达;si MALAT1促进mi RNA181b、抑制GRP78的表达。研究结论:计算机生物学软件预测得出小鼠lnc RNA MALAT1与mi RNA181b之间存在结合位点,经验证位点可靠;lnc RNA MALAT1与mi RNA181b可以相互负向调控。第二部分低氧低糖条件下,lnc RNA MALAT1与mi RNA181b的表达变化及二者对细胞增殖迁移、VEGFA/MMP2/MMP9/VEGF/AKT/P-AKT的调节研究目的:TNF-α刺激和低氧低糖条件下lnc RNA MALAT1与mi RNA181b的表达变化及二者对细胞增殖迁移、VEGFA/MMP2/MMP9/VEGF/AKT/P-AKT的调节。研究方法:首先不同浓度的TNF-α刺激b End3细胞,不同时间点检测细胞的增值(MTT法)迁移(Transwell法)情况,摸索最佳的TNF-α刺激浓度。采用q-PCR检测TNF-α刺激下lnc RNA MALAT1、mi RNA181b的表达水平,同时利用OGD致目标细胞缺血模型,检测二者的表达水平;最后过表达/抑制mi RNA181b及抑制lnc RNA MALAT1表达检测VEGFA、MMP2、MMP9、AKT、P-AKT的表达水平。研究结果:10ng/ml,20ng/ml,50ng/ml浓度下对b End3细胞的增殖基本一致,各浓度刺激下的细胞增殖计数差异不明显,但较对照组细胞增殖明显(P<0.001);细胞培养24小时较其他时间点细胞增殖明显(P<0.05)。TNF-α刺激b End3细胞,培养24小时后,促进细胞增值迁移,同时促进mi RNA181b表达、抑制lnc RNA MALAT1表达。b End3细胞完成24小时的OGD刺激后复氧复糖培养24小时,促进mi RNA181b表达,抑制lnc RNA MALAT1表达。mi RNA181b mimics/inhibitor转染b End3后培养24小时:mimics组促进细胞增殖、迁移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表达;inhibitor组抑制细胞增殖不明显,但抑制细胞迁移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表达。si MALAT1组促进细胞增殖、迁移及VEGFA、MMP2、MMP9、VEGF、AKT、P-AKT的表达。研究结论:缺血性脑卒中后,Lnc RNA MALAT1与mi RNA181b结合而竞争性地调控mi RNA181b的功能,同时mi RNA181b也能够负性调控lnc RNA MALAT1的表达水平,通过促进内皮细胞中VEGFA、AKT、P-AKT的表达,激活PI3K/Akt信号通路,同时激活Src信号通路,促进内皮细胞足体环局部α6β1整合素增多,激活金属基质蛋白酶MMPs(MMP2、MMP9),增加足体环向胞外迁移动,最终影响内皮细胞的增殖、迁移,促进血管新生。