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第一部分靶向干预GSK-3β/β-catenin信号通路抑制磨损颗粒引起的骨溶解目的:探讨氯化锂(Li Cl),糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的一种选择性抑制剂,对钛颗粒诱导炎症性骨溶解的治疗作用。方法:雌性C57BL/6小鼠84只,采用随机数字表法分为4组:对照组(Control),Ti颗粒组(Ti组),Li Cl低剂量治疗组(L-Li Cl组)和高剂量治疗组(H-Li Cl组),每组21只小鼠。Control组仅接受假手术,术后每天灌胃300μl等渗盐水;Ti组在小鼠颅骨表面植入Ti颗粒,术后每天灌胃300μl等渗盐水;L-Li Cl和H-Li Cl组,Ti颗粒植入后,分别灌胃50或200 mg kg-1d-1Li Cl。给药2周后,使用CO2箱处死小鼠,保留颅骨及外周血,分别行micro-CT、组织病理学染色、RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射免疫分析、血常规及血生化等检测。结果:Micro-CT结果显示治疗组颅骨骨溶解现象明显减轻,骨密度、骨体积、骨体积分数L-Li Cl组和H-Li Cl组分别比Ti组增加23.8%、51.7%,18.1%、45.8%,21.7%、43.9%;骨陷窝数减少了37.5%和59.8%,差异有统计学意义(p<0.05)。H&E染色结果表明,Ti组骨膜内有大量巨噬样细胞,L-Li Cl组和H-Li Cl组炎症反应明显减轻。Ti组骨溶解面积(BES)和颅骨厚度(BT)分别为(0.13±0.03)mm2、(0.12±0.04)mm,L-Li Cl组和H-Li Cl组分别为(0.07±0.01)mm2、(0.04±0.008)mm2,(0.16±0.03)mm、(0.22±0.11)mm,与Ti组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)结果显示,Ti组颅骨溶解侧可见大量TRAP阳性细胞,治疗后TRAP阳性细胞数量显著减少。免疫组织化学染色结果表明Li Cl能增加p Ser9-GSK-3β、β-catenin、ALP、Osterix和OPG的表达,抑制RANKL、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达,而不影响GSK-3β的表达。RT-PCR结果显示,Ti颗粒显著上调破骨细胞活化相关基因Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR m RNA的表达,经治疗后,上述基因m RNA表达水平降低,与Ti组比较差异有统计学意义(p<0.05)。Ti颗粒能抑制β-catenin和axin-2基因m RNA的表达,阻断GSK-3β后β-catenin和axin-2基因m RNA的表达明显增加。ELISA结果表明,Li Cl能促进OPG的分泌,抑制RANKL的表达,降低RANKL/OPG比值,与Ti组比较差异有统计学意义(p<0.05)。Ti组I型胶原羧基末端肽(CTX)的表达量为50.72±7.88ng/ml,与Control组36.97±7.85ng/ml比较,差异有统计学意义(p<0.05);L-Li Cl组和H-Li Cl组CTX表达量分别为52.20±3.86ng/ml和53.38±8.54ng/ml,与Ti组比较差异无统计学意义(p>0.05)。Ti组I型前胶原氨基端肽(P1NP)和骨钙素(OCN)的表达量分别为42.63±6.31ng/ml和41.40±7.76ng/ml,与Li Cl治疗组[L-Li Cl组:52.53±9.07ng/ml、49.92±5.54ng/ml,H-Li Cl组:62.70±9.43ng/ml、58.97±9.62ng/ml]比较,差异有统计学意义(p<0.05)。Ti组颅骨体外培养上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量明显增加,Li Cl能抑制上述因子的表达,且抑制作用呈剂量依赖性(p<0.05)。血常规和血生化结果显示药物组白细胞数量,血红蛋白含量,血小板数量,天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶、血尿素氮和肌酐的含量与Ti组比较,差异无统计学意义(p>0.05)。结论:氯化锂通过调节GSK-3β/β-catenin信号通路,促进新骨形成,抑制骨吸收,减轻磨损颗粒引起的炎症性反应,抑制骨溶解。第二部分钛颗粒调控GSK-3β/β-catenin信号通路抑制成骨细胞分化目的:观察Ti颗粒对成骨细胞分化、炎症因子释放以及RANKL和OPG表达的影响,探讨GSK-3β/β-catenin在磨损颗粒调控成骨细胞功能中的作用。方法:以小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1为研究对象,分别以Ti颗粒,GSK-3β的靶向抑制分子(Li Cl)和(或)β-catenin靶向抑制因子(槲皮素)处理。CCK-8法检测MC3T3-E1细胞增殖率;对硝基苯磷酸盐实验检测ALP活性,茜素红染色检测细胞矿化能力;RT-PCR检测Runx2、Osterix、OCN、RANKL、OPG、TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、β-catenin和axin-2基因m RNA含量,Western blot检测GSK-3β、p Ser9-GSK-3β和β-catenin蛋白表达,免疫荧光染色观察β-catenin的亚细胞定位,双荧光素酶报告基因检测Wnt/β-catenin信号通路转录活性,ELISA检测RANKL、OPG、IL-6和PGE2的表达。结果:CCK-8结果表明0.1mg/ml Ti颗粒对MC3T3-E1细胞活性无影响。共培养3d时,Ti组(0.1mg/ml)ALP活性(26.7±2.9 nmol PNPP/min/μg protein)与Control组(37.9±4.2nmol PNPP/min/μg protein)比较,差异有统计学意义(p<0.05);Ti组Runx2、Osterix和OCN基因m RNA表达明显减少,与Control组比较,差异有统计学意义(p<0.05);茜素红染色结果提示Ti组红色深染区域明显减少。进一步研究发现Ti作用后,MC3T3-E1细胞中p Ser9-GSK-3β的表达下降,细胞核内β-catenin的含量减少,Wnt/β-catenin信号通路转录活性明显降低。RT-PCR结果发现Ti组β-catenin和axin-2基因m RNA的含量较Control组分别下降了48.6%和45.9%,差异有统计学意义(p<0.05)。加入Li Cl(10m M)后,p Ser9-GSK-3β表达上调,细胞核内β-catenin含量增加,Wnt/β-catenin信号通路被活化。阻断GSK-3β后,ALP活性上升了31.2%,Runx2、Osterix和OCN基因m RNA含量明显增加,茜素红染色结果也提示Li Cl干预后矿化结节明显增多,与Ti组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。以β-catenin靶向阻断剂(50μm槲皮素)处理后,Li Cl对Wnt/β-catenin信号通路的活化明显减弱,该通路下游靶基因axin-2的表达显著减少(p<0.05)。RT-PCR结果显示,Li Cl能促进OPG的表达,抑制RANKL的表达;ELISA检测结果显示,Ti+Li Cl组RANKL和OPG的含量分别为11.24±2.16pg/ml和2.45±0.32ng/ml,与Ti组(RANKL:17.36±2.28pg/ml;OPG:0.67±0.17ng/ml)比较,差异有统计学意义(p<0.05);RANKL/OPG的比值由(25.75±3.21)/103(Ti组)下降到(4.76±0.89)/103(Ti+Li Cl组)(p<0.05)。Ti作用后MC3T3-E1细胞中TNF-α和IL-β的表达没有显著变化,IL-6和COX-2基因m RNA的含量与Control组比较分别增加了6.6倍和3.4倍,抑制GSK-3β后,IL-6和COX-2基因m RNA的表达显著降低。ELISA结果显示Ti组IL-6和PGE2的含量分别为694.86±81.59pg/ml和17.68±1.63ng/ml,与Ti+Li Cl组(IL-6:262.82±41.91pg/ml;PGE2:7.32±1.18ng/ml)比较,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:磨损颗粒通过活化GSK-3β,阻断β-catenin的核转位,抑制MC3T3-E1细胞成骨分化,上调RANKL/OPG比值,促进炎症因子IL-6和COX-2/PGE2的表达。Li Cl通过活化β-catenin信号通路,下调RANKL/OPG的比值,抑制炎症因子IL-6和COX-2/PGE2的表达,并能够阻断Ti对成骨细胞分化的抑制作用。第三部分氯化锂调控成骨细胞抑制磨损颗粒诱导的破骨细胞活化目的:观察Li Cl干预MC3T3-E1细胞来源的条件培养基(Li-CM)对磨损颗粒诱导炎症性破骨细胞活化的影响。方法:以小鼠单核/巨噬细胞系RAW264.7为研究对象,运用条件培养基实验,观察Li-CM对RANKL(50ng/ml)和Ti颗粒(0.1mg/ml)诱导破骨细胞活化的影响。以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测成熟破骨细胞;以骨吸收培养板检测破骨细胞骨吸收能力;以RT-PCR检测Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR、NFATc1、MMP-9、TNF-α和IL-1β基因m RNA含量;Western blot检测NFATc1、MMP9、IκBα和p-IκBα表达水平;ELISA检测TNF-α和IL-1β的表达水平。结果:TRAP染色结果显示OB-CM组、Ti-CM组均可见大量的紫红色多核细胞,Li-CM组多核细胞较少,统计分析结果表明Li-CM(50%)组TRAP阳性细胞数量(138.8±14.7个/cm2)与Li-CM(0%)组(228.3±22.4个/cm2)比较差异有统计学意义(p<0.01)。RT-PCR结果显示Li-CM组破骨细胞活化相关基因Cath-K、CTR、TRAP、OSCAR、NFATc1和MMP-9表达量显著降低,与Control组比较,差异有统计学意义(p<0.05)。骨吸收培养板结果显示Li-CM(50%)组骨吸收面积比较Control组下降了50.8%(p<0.05)。Li-CM(50%)干预后TNF-α和IL-1β基因m RNA含量显著下降,与Control组比较,差异有统计学意义(p<0.05);ELISA结果显示Li-CM(50%)组TNF-α和IL-1β的含量分别为481.4±62.8pg/ml和244.2±31.9pg/ml,与Control组(637.9±82.3pg/ml和315.7±37.5pg/ml)比较,差异有统计学意义(p<0.05)。Western blot结果显示RANKL和Ti颗粒能增加p-IκBα、NFATc1和MMP-9的表达,Li-CM(50%)能明显抑制上述因子的表达。荧光素酶报告基因检测结果显示RANKL和Ti干预8h后,NF-κB转录活性增加了9.1倍,而以Li-CM干预后,NF-κB转录活性显著降低,差异有统计学意义(p<0.05)。结论:Li-CM能有效地抑制钛颗粒引起的炎症性破骨细胞活化。