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目的:通过建立体外培养大鼠Leydig细胞体系,观察镍对MAPK信号通路蛋白及其磷酸化水平的影响,以及MAPK信号通路与睾酮合成障碍之间的关系,探讨MAPK信号通路在镍致大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中的作用。方法:（1）采用0.25%胶原酶Ⅳ分离大鼠Leydig细胞,Percoll梯度（5,30,58和70%）离心以及体外贴壁培养法纯化大鼠Leydig细胞,3β-羟类固醇脱氢酶（3β-HSD）法进行大鼠Leydig细胞鉴定。（2）选择处于对数生长期的大鼠Leydig细胞,给予不同浓度的硫酸镍（250、500、1000μmol/L）分别对其体外染毒处理24 h;分别采用MAPK信号通路抑制剂（U0126,SB203580,SP600125）预处理30 min,再对其进行1000μmol/L硫酸镍或空白处理24 h。（3）酶联免疫吸附试验法（ELISA）检测Leydig细胞培养液中睾酮含量。（4）实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测大鼠Leydig细胞睾酮合成酶类固醇合成快速调节蛋白（StAR）、细胞色素P450胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）、3β-HSD、类固醇17α-羟化酶（CYP17A1）和17β-羟类固醇脱氢酶（17β-HSD）的mRNA表达水平。（5）Western blot检测大鼠Leydig细胞睾酮合成酶StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD的蛋白表达水平以及MAPK信号通路相关蛋白MEK1/2、ERK1/2、MKK3、p38、MKK7和JNK的总蛋白表达水平及其蛋白的磷酸化水平。结果:（1）不同浓度NiSO4处理大鼠Leydig细胞24 h后,与对照组比较,250μmol/L NiSO4组睾丸Leydig细胞MEK1/2蛋白的磷酸化水平升高（P<0.05）;500μmol/L和1000μmol/L NiSO4组MEK1/2、ERK1/2、MKK3、p38、MKK7和JNK蛋白的磷酸化水平均显著升高（P<0.05）。（3）与对照组比较,1000μmol/L NiSO4组Leydig细胞MEK1/2、ERK1/2、MKK3、p38、MKK7和JNK蛋白的磷酸化水平显著增加（P<0.05）,抑制剂+NiSO4（U0126+1000μmol/L NiSO4、SB203580+1000μmol/L Ni SO4和SP600125+1000μmol/L NiSO4）组以及抑制剂（U0126、SB203580和SP600125）组Leydig细胞MEK1/2、ERK1/2、MKK3、p38、MKK7和JNK蛋白的磷酸化水平均无明显变化（P>0.05）。与1000μmol/L NiSO4组比较,抑制剂+NiSO4（U0126+1000μmol/L NiSO4、SB203580+1000μmol/L NiSO4和SP600125+1000μmol/L NiSO4）组以及抑制剂（U0126、SB203580和SP600125）组上述蛋白的磷酸化水平显著降低（P<0.05）。（4）与对照组比较,1000μmol/L NiSO4显著降低睾酮分泌量以及睾酮睾酮合成相关酶StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD的mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）,抑制剂+NiSO4（U0126+1000μmol/L NiSO4、SB203580+1000μmol/L NiSO4和SP600125+1000μmol/L NiSO4）组以及抑制剂（U0126、SB203580和SP600125）组Leydig细胞睾酮分泌量以及睾酮合成相关酶的mRNA和蛋白表达水平无明显变化（P>0.05）。与1000μmol/L NiSO4组比较,抑制剂+NiSO4（U0126+1000μmol/L NiSO4和SB203580+1000μmol/L NiSO4）组以及抑制剂（U0126、SB203580和SP600125）组Leydig细胞睾酮分泌量以及上述睾酮合成相关酶的mRNA和蛋白表达水平显著升高（P<0.05）;SP600125+1000μmol/L NiSO4组睾酮分泌量无明显变化（P>0.05）,StAR、CYP11A1、CYP17A1和17β-HSD的mRNA表达水平显著升高（P<0.05）,3β-HSD的mRNA无明显变化（P>0.05）;StAR、CYP11A1、3β-HSD、CYP17A1和17β-HSD的蛋白表达水平显著升高（P<0.05）。结论:NiSO4可激活体外培养大鼠Leydig细胞ERK1/2、p38 MAPK和JNK信号通路。ERK1/2、p38 MAPK信号通路抑制剂U0126和SB203580均可阻抑NiSO4诱导大鼠Leydig细胞ERK1/2、p38 MAPK信号通路的激活,进而逆转NiSO4所致的Leydig细胞睾酮合成相关酶的mRNA和蛋白表达下调以及睾酮分泌量下降,表明ERK1/2和p38 MAPK信号通路在NiSO4诱导的大鼠Leydig细胞睾酮合成障碍中发挥重要的作用。