论文部分内容阅读
背景与目的：子痫前期是妊娠期特有的并发症，是全世界范围内围产期孕产妇和围生儿死亡率和发病率的首要原因，严重影响母儿健康。其发病机制的研究一直是产科领域的热点。与子痫前期发病机制相关的有众多的学说如遗传因素、免疫耐受失衡、胎盘缺血缺氧学说、血管生成与抗血管生成因子失衡等，但启动子痫前期发病的具体机制并不明确，目前“两阶段学说”广为接受。第一阶段：在妊娠的早期的胎盘形成期，绒毛膜外滋养细胞开始迁移和侵袭子宫肌层的螺旋动脉，在此阶段内如各种因素致使滋养细胞功能异常，导致滋养细胞运动能力减弱，子宫螺旋动脉重塑障碍以至于“胎盘浅着床”，为子痫前期的病理学基础；第二阶段：在胎盘形成之后，因子宫螺旋动脉重铸不足导致子宫螺旋动脉管腔较正常妊娠狭窄。子宫螺旋动脉血流阻力增加，胎盘灌注不足，氧化应激、缺血缺氧代谢障碍，胎盘源性不良因子大量释放到母体血液中，诱发母体发生过度全身炎症反应和血管内皮功能障碍，最终引发子痫前期。在此过程中，滋养细胞的功能对子痫前期发病的机制有着至关重要的影响。近年来有研究表明长链非编码RNA可通过调节滋养细胞的功能参与子痫前期的发病机制。因此探究长链非编码RNA调节滋养细胞的功能的潜在分子机制，可能在研究子痫前期发病机制的进展以及改善子痫前期患者临床预后具有重要意义。 方法：（1)我们使用长链非编码RNA芯片技术获取子痫前期胎盘与正常妊娠胎盘组织间的LncRNA;(2)运用生物信息学等方法挑选候选差异表达的LncRNA;(3)在20对子痫前期胎盘及正常妊娠胎盘组织样本中进行RT-PCR的验证，确定后续实验的LncRNA，并进一步用RT-PCR检测在早孕绒毛组织和晚孕正常胎盘组织中LncRNA表达情况。(4)在滋养细胞中过表达LncRNA后进行质谱分析，同时滋养细胞过表达和敲降LncRNA,通过细胞划痕、Transwell、EDU细胞增殖实验及流式细胞凋亡实验等实验评估其对滋养细胞生物学功能的影响。（5)在HTR8/SVneo细胞和原代细胞中用FISH检测LncRNA亚细胞定位。在滋养细胞中过表达和敲降LncRNA后，用明胶酶谱检测MMP-2蛋白的活性；然后运用mRNA芯片筛选出下游可能的结合的mRNA,运用RT-PCR在过表达和敲降LncRNA的滋养细胞中验证筛选的mRNA表达情况，用双荧光素酶报告、RT-PCR证实LncRNA与mRNA结合，Westem-blot方法检测mRNA编辑的蛋白表达变化。 结果：在子痫前期胎盘组织中差异表达的LncRNA共24个（差异倍数大于±1.5，且p<0.05)，其中共有20个LncRNA上调，4个LncRNA下调；选择其中三个髙表达的LncRNA在子痫前期和正常孕妇的胎盘组织中进行验证，其中LncZBTB39的表达情况和芯片结果一致。因此我们把LncZBTB39作为后续研究对象，在早孕绒毛组织和晚孕正常胎盘组织中检测到LncZBTB39表达的显著差异。我们在HTR8/SVneo细胞中过表达LncRNA后，进行质谱检测，发现HTR8/SVneo细胞中三羧酸循环相关产物及ATP显著下降。接着FISH检测HTR8/SVneo和胎盘原代滋养细胞中，LncZBTB39主要表达在细胞质，细胞核内少量表达。随着LncZBTB39表达量在HTR8/SVneo细胞中升髙，HTR8/SVneo细胞的增殖、迁移及侵袭能力显著下降，而细胞的凋亡率显著增加。同时，LncZBTB39表达的降低时，滋养细胞HTR8/SVneo的增殖、迁移及侵袭能力显著下降及凋亡率就呈现相反的情况。接下来，在滋养细胞中过表达和敲降LncRNA后，发现MMP-2蛋白活性变化与LncZBTB39—致；运用mRNA芯片筛选出下游可能的结合的8个mRNA，运用RT-PCR在过表达和敲降LncZBTB39的滋养细胞中验证这些mRNA的表达情况，结果表明其中TAC3和THSD7A的表达变化和LncZBTB39显著相关（P＜0.05)，双荧光素酶报告显示LncZBTB39与TAC3相结合，Westem-blot方法检测TAC3编辑的蛋白NKB表达变化，与TAC3的变化一致；同时在HTR8/SVneo细胞中过表达LncZBTB39和加不同剂量miR-210mimics后，再运用RT-PCR检测THSD7A的表达变化与miR-210mimics剂量变化有相关性。 结论：子痫前期与正常胎盘组织中存在显著差异表达的长链非编码RNA，说明LncRNA与子痫前期存在相关性；LncZBTB39在子痫前期和正常胎盘组织、及早孕期绒毛组织的滋养细胞中表达量有明显差异；明确了LncZBTB39在HTR8/SVneo中起到抑制细胞增殖、侵袭、迁移并促进细胞凋亡的作用；揭示了LncZBTB39通过调节滋养细胞生物学功能和调节TAC3、THSD7A的表达参与子痫前期的发病机制。