空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)是一种在世界范围内引起人类胃肠炎的主要食源性致病菌,严重感染时也可能引起格林-巴利综合症、米歇尔综合征和菌血症。随着近年越来越多的研究发现,空肠弯曲杆菌的耐药问题日益严重,由空肠弯曲杆菌感染引起的人类及动物性疾病也越来越多。为了更有效的预防和控制耐药空肠弯曲杆菌以及由其引发疾病的产生,必须了解清楚致病性耐药菌的产生原因及其耐药和毒性的产生机制。本实验室前期在临床上采集了疑似空肠弯曲杆菌样本,本实验以6株鸡源菌株为研究对象,通过耐药表型和毒力表型试验筛选出了一株具有多重耐药且致病性相对较强的菌株(编号为1655),并通过全基因组从头测序技术,运用分子生物学手段对筛选出的菌株进行基因组特征、耐药机制及致病机制的分析,并试图阐明耐药和毒力之间的关系。本课题在一定程度上解释了临床致病性耐药空肠弯曲杆菌的发生机理,并为生物信息库提供了有利数据,同时为防止弯曲杆菌耐药性和致病性的产生和传播提供了理论指导和技术支撑。1.临床疑似空肠弯曲菌菌株的PCR鉴定和MIC测定将实验室之前用甘油保存于-80℃的6株疑似空肠弯曲杆菌的菌株(编号分别为1442、1447、1614、1622、1655和16851以及RM1221和ATCC33560进行复苏。用微量移液枪取出501μL涂布于预先准备好的改良Skirrow氏血平板上,接种好后置42℃微需氧孵育24-48h左右,观察菌落形态,然后挑取单菌落于MH肉汤中传代两次。提取细菌基因组DNA,根据查阅文献设计鉴定空肠弯曲杆菌的两对引物16S和mapA,对复苏的疑似菌株进行PCR鉴定,两对引物的扩增片段长度分别是857bp和589bp,经PCR鉴定以及测序分析,最终确定6株疑似菌株均为空肠弯曲杆菌。采用琼脂稀释法进行6株菌的药物敏感性试验,以ATCC33560作质控。主要关注常用于空肠弯曲杆菌病治疗的四大类药物,分别是氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和氨基糖苷类。选取这四大类药物的8种代表药测定MIC。结果显示：6株菌对这8种药物均产生了耐药性,可见临床菌株的耐药现象还是非常严重的。2.临床空肠弯曲菌的体内毒性试验以及LDso的测定以预试剂量1×109CFU/mL(通过计数得到)的菌液1mL采用腹腔注射感染雏鸡,1442、1622和1655组在24h内都出现了不同程度的死亡,其中以1655组最为严重,因此,初步筛选这3株菌进行LDso的测定,方法为改良寇氏法。结果显示：以浓度3.7×108CFU/mL菌液1mL口服感染2日龄的健康雏鸡,感染两周后1442和1622组只有高浓度组出现了1-2只的死亡,因此无法计算LD50,而1655组在不同浓度出现了不同的死亡率,计算出的LD50为8.45×107CFU/mL。以同样浓度和剂量对2日龄的健康雏鸡进行腹腔注射感染,虽然1442组和1622组在不同浓度下出现了不同的死亡率,但1655组在最低浓度3.7×105CFU/mL下也出现了100%的死亡率。结合口服感染的实验结果,说明1655菌株具有相当强的毒力。同样再以3.1×108CFU/mL的剂量腹腔注射感染16日龄的小鸡,1442和1622组基本没出现死亡,但1655组出现了相当高的死亡率,LD5o为1.60×107CFU/mL.因此,初步断定1655菌株具有一定的致病性。3.细菌黏附、侵袭以及胞外生存能力的考察LD50的测定考察了菌株的体内毒性情况,还需对菌株的体外毒性进行检测,包括检测菌株对细胞的侵袭和黏附能力,以及菌株在体外的生存活力。选用RAW264.7细胞,采用庆大霉素保护法对初筛的1442、1622以及1655菌株进行细胞实验,RM1221作为参照菌。结果显示：3株临床菌株的黏附和侵袭能力与RM1221相比都有显著性差异。但就3株临床菌而言,它们之间的黏附和侵袭能力没有显著差异,结合胞内生存能力实验,1442可以存活至48h,而1622和1655可以存活至72h,并且可以明显看出,在每个时间点,1655菌株的侵袭数还是明显比1622高,可能这也是它表现出比其它两株菌毒性更强的原因。因此后续试验将1655菌株作为重点研究对象,对其进行全基因组测序分析相关耐药和毒性机制。4.全基因组从头测序-De novo测序用试剂盒提取靶菌1655的基因组,样品送自公司进行质检、文库构建以及质控等工作,然后上机测序,选定的测序方法为Solexa,本测序实验要求为双端测序,读长为100nt,构建一个随机文库。测序完成后进行Contig的拼接、基因组环状草图的完成、基因组的预测以及注释等工作,然后运用生物信息学技术对测序结果进行耐药和毒性机制的分析。结果显示：1655菌株存在已报道的引起这四类药物高水平耐药的机制,如引起氟喹诺酮类药物高水平耐药的gyrA基因上的Thr-86-Ile位点的突变,大环内酯类23SrRNA上A2075G位点的突变,介导四环素和氨基糖苷类耐药的tetO外源基因的获得以及导致氨基糖苷类耐药aph-A和aaddE基因的存在。并且预测到了一个编码未知功能蛋白质的基因位于质粒pCG8245上,此质粒为一个抗性质粒,对于其编码的未知功能的蛋白质进行进一步研究,或许可以发现新的耐药机制。此外,还发现了一些之前没有报道过的突变和缺失,或许与菌株的多重耐药有关。对毒性机制的分析结果：基因序列分析表明,1655菌株除了携带对致病性产生作用的毒力因子外,没有注释到编码毒力基因的噬菌体、毒力岛以及与IV型分泌系统同源的基因,但已知的致病因素(比如,携带的毒力因子)或许可以解释它的致病性；比较基因组学分析发现了大量的SNPs;通过与参考基因组RM1221、11168以及81-176的共线性分析发现1655菌株基因组存在严重的缺失、重排以及倒位现象(包括内部编码和基因间区域),这表明适度的遗传变化可能使1655的毒力增强。此外,在1655菌株染色体上存在的与毒性相关的可变基因区、噬菌体、转座子、铁摄取系统以及发现的质粒pTet可能都参与了菌株的毒性机制。分析结果还显示,菌株间的基本基因内容存在差异,这也为后续的分析提供了新的视角。另外还预测到了一些未知功能的蛋白质、发生突变缺失的序列以及与对照菌株有差异的生物学成分,这些基因的共同作用或许会对细菌的耐药和毒力产生影响。鉴于临床分离株复杂的环境背景,导致其产生致病性的原因也比较复,因此仅从基因组内容和结构差异上进行分析不够全面,有些机制无法解释清楚。综上所述,本试验通过一系列耐药和毒性实验成功筛选出了一株具有致病性的多重耐药菌株,并通过全基因组测序的方法,应用分子生物学技术对其相关机制进行了深入分析,阐明了临床菌株产生多重耐药以及致病性的原因,对于其复杂的耐药和致病机制也进行了初步分析,并且发现了一些新的可能与耐药和毒力相关的机制。因此,本课题为临床致病性多重耐药空肠弯曲菌研究提供了依据；为完善弯曲杆菌的耐药机制拓宽了思路；为研究弯曲菌病的致病机理提供了新的方向。此外本研究成果中,对于基因结构和内容的分析,也为完善空肠弯曲菌基因组信息提供了有利证据。