论文部分内容阅读
草铵膦是一种新型、高效的除草剂,由于具有良好除草效果以及在转基因植物上的应用而广受关注。国内外的报道研究了很多化学法及生物法合成草铵膦的途径,而能够工业化的方法却鲜有报道。通过腈水解酶法催化2-氨基-4-（甲基磷酰基乙酯）-丁腈生成L-草铵膦,解决了合成过程中最关键的一步反应,转化率高同时对环境友好。本论文旨在建立底物氨基腈的完整的除盐提纯工艺,然后探索可行的氨基腈水解酶的高通量筛选方法进行菌株的筛选,最后所筛选菌株生长条件进行优化,建立生物法生产L-草铵膦的路线。本论文首先用离子交换法对工厂合成的底物溶液进行提纯。在被研究的9种树脂中,阳离子树脂001×7表现出对底物最佳的吸附能力,最佳上样液的pH为2.0。然后通过固定床的实验研究,上样流速为1mL/min,洗脱剂为0.4 M的氨水,洗脱流速为0.04 BV/min,在此条件下,得到了纯度高于90%的底物,可以用于下一步L-草铵膦的合成及产腈水解酶菌株的筛选。本文建立了两种可行的高通量筛选方法苯酚-次氯酸盐法和奈氏试剂法。苯酚-次氯酸盐法经过优化后其组成为;NaOH浓度为4 g/L、NaClO浓度0.2 g/L、亚硝基铁氰化钠浓度为0.075 g/L、苯酚浓度为10 g/L。经验证发现两种高通量筛选模型的结果与高效液相色谱结果十分吻合,可以用来进行含腈水解酶菌株的高通量筛选。然后,通过以2-氨基-4-（甲基磷酰基乙酯）-丁腈为唯一氮源,进行了野生菌的筛选,最后得到24株能够产生L-草铵膦的菌株,在这些菌株中,Enterobacter sp.ZJB-15078转化率最高,达到17.9%。论文通过单因素变量实验,对所筛选得到的菌株Enterobacter sp.ZJB-15078发酵条件进行优化。优化后的培养基组成为:乳糖15 g/L,牛肉膏10 g/L,已内酰胺1.5 g/L,ZnCl2 0.01 g/L,KH2PO4 1.0 g/L,K2HPO4 1.0 g/L。接着进一步考察其它发酵条件对于菌株发酵的影响,研究得到培养基的初始pH 6.5、接种量为3%（v/v）时菌株产酶最好,在这个条件下,培养36 h后菌株内氨基腈水解酶的活力得到20.57U/L,是优化前活力的1.3倍。