论文部分内容阅读
目的:研究内吗啡肽-1和内吗啡肽-2以及Mu阿片受体在小鼠树突状细胞的表达及其相关的功能。方法:从7-8周龄的C57BL/6J小鼠骨髓提取骨髓前体细胞培养,经CD11c免疫磁珠分选,获得纯化的树突状细胞。流式细胞仪分析表明,CD11c(树突状细胞的特异性标记)阳性细胞纯度达95%以上。首先,研究Mu阿片受体是否在鼠树突状细胞表达。用RT-PCR的方法,检测Mu阿片受体基因在树突状细胞上的表达;用激光共聚焦显微镜观察免疫荧光染色,观察Mu阿片受体蛋白在树突状细胞上的表达;同时,用定量PCR的方法,研究了不同Toll样受体(TLR)的配体对Mu阿片受体基因表达的调控。其次,研究树突状细胞是否产生内吗啡肽-1和内吗啡肽-2。用免疫荧光染色研究了内吗啡肽-1和内吗啡肽-2在树突状细胞的表达;用酶免疫测定(EIA)的方法,检测了培养树突状细胞的上清中的内吗啡肽-1和内吗啡肽-2的含量,反映内吗啡肽从树突状细胞的分泌。最后,在证实了树突状细胞表达内吗啡肽-1、内吗啡肽-2和Mu阿片受体的基础上,进一步探讨树突状细胞内吗啡肽/Mu阿片受体的功能意义。用脂多糖(LPS)激活树突状细胞,用naloxone作为阿片受体非特异性拮抗剂,用CTOP作为Mu阿片受体特异性拮抗剂,用竞争结合的方法检测了树突状细胞内由forskolin引起的cAMP的生成;用Western blot的方法,观察了内吗啡肽-1对树突状细胞内磷酸化p38 MAPK和ERK的表达,以判断p38 MAPK和ERK两条信号通路的活化状态;运用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法,检测了内吗啡肽-1促使树突状细胞分泌的细胞因子IL-10、IL-12和IL-23的浓度;在树突状细胞和T淋巴细胞共培养的条件下,用氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入测定的方法检测了T淋巴细胞的增殖能力。结果:在Mu阿片受体方面,RT-PCR的结果表明,经LPS活化的树突状细胞表达Mu阿片受体的mRNA。免疫荧光双标染色的结果表明,Mu阿片受体蛋白与树突状细胞的CD11c分子共表达于细胞膜上;而且,定量PCR的结果表明,不同的TLR配体均可显著上调Mu阿片受体基因的表达,特别是LPS和Poly (I:C)上调更为明显;LPS活化的树突状细胞在6小时后便出现Mu阿片受体mRNA的表达,表达水平逐步升高,于24小时达到顶峰,并在随后的12-24小时内维持在较高的表达水平。在内吗啡肽方面,免疫荧光染色表明,活化的树突状细胞内产生内吗啡肽-1和内吗啡肽-2;酶免疫测定(EIA)检测的结果表明,不同的TLR配体活化树突状细胞促使分泌不同浓度的内吗啡肽-1和内吗啡肽-2。对内吗啡肽/Mu阿片受体在树突状细胞的功能研究表明,内吗啡肽-1可显著降低胞内forskolin引起的cAMP的生成;能降低p38MAPK信号通路的活化,增加ERK信号通路的活化;相应地,经过内吗啡肽-1处理的LPS活化的树突状细胞,增强IL-10的产生和分泌,降低IL-12和IL-23的产生和分泌;与T淋巴细胞体外共培养时,经内吗啡肽-1或内吗啡肽-2处理的树突状细胞能抑制T淋巴细胞的增殖反应。上述内吗啡肽的作用都能被阿片受体非特异性拮抗剂naloxone和Mu阿片受体特异性拮抗剂CTOP翻转或部分翻转,提示内吗啡肽的作用都是由Mu受体介导的。结论:活化的树突状细胞诱导性表达Mu阿片受体和内吗啡肽。内吗啡肽可通过Mu阿片受体影响胞内的信号通路,改变树突状细胞的功能特性,调节免疫反应。