研究背景和目的肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是全球发病率最高的恶性肿瘤之一，我国每年约有13万人死于HCC及其相关疾病。目前认为根治性切除手术是HCC最有效的方法，可以获得长期生存。然而术后复发和转移成为阻碍患者长期存活的重要因素。较多研究表明，部分肝癌患者在肝癌根治性切除手术前，已有肿瘤细胞脱落进入血，是导致肝癌血行转移的必要前提。其中侵入血循环中的肿瘤细胞被称为循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs），是肝癌术后复发和转移的根源，可能是一个很好的预测疗效指标。CTCs既是原发灶和转移灶之间的链接，又是肿瘤生物学和转移的窗口。这使其将来可能成为研究肿瘤转移复发过程及机制的重要突破口，因此，它也将在制定个体化肿瘤治疗方案中成为不可或缺的生物标志物。鉴于上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是诱导CTCs产生并促进转移的一个关键因素，在CTCs分子诊断和靶向治疗方面的应用研究正受到越来越多的关注，可能成为判断多种恶性肿瘤转移及预后的分子标志。通过在我们实验室前期研究的基础上，建立了一种基于去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）及其配体相互作用的磁性分选联合肝细胞特异性抗体Hep Par1进行鉴定的肝癌CTCs分离/鉴定系统。由于配体-受体结合具有自身的缺陷，我们成功制备高特异性人ASGPR小鼠单克隆抗体，建立了一种基于ASGPR抗体和抗原相互作用的磁性分选联合肝细胞特异性抗体氨甲酰磷酸合成酶1（carbamoyl phosphate synthetase1，CPS1）与细胞角蛋白（cytokeratins，CKs）混合抗体进行免疫鉴定的肝癌CTCs分离/鉴定系统，具有较高的检测率。在本课题第一部分研究中，我们针对鉴定过程中CKs潜在的假阳性以及CPS1在肝癌中有异质性表达，降低鉴定效率的现象，采用CPS1联合ASGPR替代CPS1与CKs，明显提高了检测率。针对阳性分选中ASGPR在肝癌细胞表面表达不均一，降低回收效率的现象，采用MACS阴性分选法替代阳性分选法，从而绕开了肿瘤异质性对富集效率的影响。通过细胞掺入试验分析了MACS阴性分选联合CPS1与ASGPR混合抗体的肝癌CTCs检测这种改进方法的回收率、特异性和敏感性，并与基于ASGPR抗体及其抗原相互作用的磁性分选技术进行了比较分析。然后应用于临床肝癌血液样本CTCs检测，比较分析了改进方法与原方法检测到的肝癌患者CTCs的数目。第二部分首先建立在鉴定肝癌CTCs的基础上检测CTCs EMT表型的多色免疫荧光染色技术。然后将改进方法应用于肝癌患者CTCs的EMT表型检测，探索CTCs的EMT表型变化对肿瘤复发转移的影响以及能否预测肝癌患者根治术后复发的风险，从而为指导个体化治疗提供帮助。研究方法1、流式细胞术检测CPS1与ASGPR在肝癌细胞系中的表达。2、免疫组织荧光检测HCC组织中CPS1与ASGPR的表达。3、Ficoll密度梯度离心分离PBMCs。4、采用包被CD45抗体的免疫磁珠对白细胞进行间接磁性标记，并通过磁场分离循环肝癌细胞。5、采用肝细胞特异性抗体CPS1+ASGPR进行检测，计数分选到的循环肝癌细胞。6、细胞掺入试验评价MACS阴性分选联合CPS1与ASGPR混合抗体的肝癌CTCs检测改进方法的回收率、敏感性和特异性。7、细胞掺入试验比较改进方法与原方法的回收率。8、采用改进方法检测27例肝癌患者CTCs，并与基于ASGPR抗体阳性分选联合CPS1与CKs鉴定的回收率进行比较分析。9、将差异表达Zeb1/Vimentin的不同肝癌细胞系分别掺入外周血（肝癌CTCs血液模型），建立和优化在鉴定肝癌CTCs的基础上检测其Zeb1/Vimentin表达的多色免疫荧光染色技术，其中鉴定肝癌CTCs的标志物采用CPS1与ASGPR混合抗体。10、采用上述所建立的多色免疫荧光染色方法检测86例临床肝癌患者第一次行切除术前5mL外周血样本CTCs中Zeb1/Vimentin表达，分析肝癌CTCs的Zeb1/Vimentin表型。11、应用免疫组织化学和免疫组织荧光技术检测上述86例对应肝癌患者组织连续切片中Zeb1/Vimentin表达情况，并与CTCs阳性率进行比较分析。12、采用上述所建立的多色免疫荧光染色方法检测肝癌患者外周血中具有Zeb1/Vimentin表型的CTM。13、定期复查和随访。实验结果1、应用ASGPR与CPS1混合抗体检测肝癌细胞系阳性率高于单个抗体检测。2、应用ASGPR与CPS1混合抗体检测肝癌组织可以避免单个抗体检测的假阴性。3、细胞掺入试验显示，改进方法中在每个掺入水平，HepG2细胞的平均回收率均≥80%，并且在所有只掺入10个HepG2细胞的5个样本中，所有样本检测到的HepG2细胞数均大于5个。在掺入100个MCF-7人乳腺癌细胞系和100个A498人肾癌细胞系的10个血样本中，均未检测出CPS1+ASGPR阳性的肿瘤细胞。4、HepG2细胞掺入试验显示，改进方法的回收率显著高于原方法（P<0.05）。5、27例HCC患者中，CTCs阳性率为89%（24/27），CTCs检出数范围0-92个/5mL外周血，均数为33±26个。在20例健康志愿者、40例良性肝病患者和17例其他5种类型晚期肿瘤病例中均未检测出CPS1与ASGPR阳性的肿瘤细胞。6、10例患者中的每位患者采用改进方法比以原方法检测到较多的CTCs（P<0.01）。其中在6例患者采用两种方法均可检测到40多个CTCs，但敏感性较以前的方法提高16-26%。7、建立的CPS1+ASGPR/Zeb1/Vimentin多色免疫荧光染色方法可在鉴定肝癌CTCs的同时检测其Zeb1/Vimentin表型，可准确检测出不同细胞之间Zeb1和Vimentin的表达差异。8、在受检的86例HCC外周血中，75例可检出CTCs，检出率达87%，检出数最小3个，最大96个，平均33±17个。在75例肝癌患者外周血中检测到4种不同的Zeb1/Vimentin表型，分别为Zeb1+/Vimentin+、 Zeb1-/Vimentin+、Zeb1+/Vimentin-和Zeb1-/Vimentin-。9、同一肝癌个体的不同CTCs之间Zeb1/Vimentin表型不尽相同。同一患者CTCs之间的Zeb1/Vimentin表型也有差异。较少患者体内只发现有1种表型的CTCs，另外一些患者体内却同时发现有2种或以上表型的CTCs，甚至同时发现有全部4种表型的CTCs。且不同表型CTCs的数目不相同，占所有检出CTCs的比例存在差异。10、在肝癌组织中也检测到4种不同的Zeb1/Vimentin表型。组织Zeb1+/Vimentin+表型与CTCs阳性率具有相关性（r=0.281，P=0.009）。11、本研究在小样本HCC患者外周血中检测到少量具有Zeb1/Vimentin表型的CTM.研究结论本研究采用MACS阴性分选联合CPS1与ASGPR混合抗体的肝癌CTCs检测方法，具有高度的敏感性和特异性，具有临床应用潜能。建立的CPS1+ASGPR/Zeb1/Vimentin多色免疫荧光染色方法简便实用，可用于循环肝癌细胞Zeb1/Vimentin表型鉴定；不同肝癌个体的CTCs之间以及同一肝癌个体的不同CTCs之间Zeb1/Vimentin表型存在异质性；组织Zeb1+/Vimentin+表型与CTCs阳性率具有相关性。肝癌CTCs Zeb1/Vimentin表型检测有可能用于筛查肝癌根治术后高复发风险的HCC患者，为指导临床治疗提供理论依据，从而进行进一步的治疗和密切随访。而靶向阻断Zeb1与Vimentin将为肝癌的治疗提供新思路。