【研究背景】雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)是一种新型大环内酯类强效免疫抑制剂,具有抗真菌?抑制肿瘤生长?特异性抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(the mammalian target of rapamycin,mTOR)蛋白活性的作用?异位骨化(Heterotopic ossification,HO)是指在正常骨骼系统之外(常见如肌肉?跟腱?关节囊等软组织)出现异常的真性骨组织?异位骨化目前主要分为两种:一种是遗传性HO,发病率低但是症状严重且死亡率高,包括由ACVR1发生激活性突变的进行性肌肉骨化症(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva,FOP)以及编码G蛋白a亚基的GNAS基因发生失活突变引起的进行性骨发育异常(Progressive Osseous Heteroplasia,POH);另一种是获得性HO,相对于遗传性HO来说,症状较轻,死亡率低,但是发病率高,患者症状的轻重往往与创伤的严重程度成正比,且与创伤部位以及创伤来源密切相关,常见的创伤来源包括如枪伤?爆炸等的战斗中损伤,如髋关节置换术等手术引起的损伤,脊髓神经系统受损,较严重的大面积烧伤等?相对而言,国际上对于遗传性HO的致病机理研究得较为广泛,一些针对潜在的致病因素的药物逐渐涌现,如维甲酸受体γ激动剂帕拉罗汀,被广泛使于FOP的患者,且疗效较好?但是纵观目前对HO研究的大环境,针对性的研究创伤性HO的文献还是相对较少的,虽然学者们做过一些相关的信号通路的研究,但是目前还不能完全理顺创伤性HO的致病机制的因果关系和整个的病因链,所以对于创伤性HO的治疗方法相对来说比较匮乏?因此,我们课题组主要致力于研究创伤性HO的致病机制与治疗方法?创伤性HO的治疗方法已经渐渐成为热点,比如说手术切除,脉冲低强度电磁场,皮质类固醇类?NSAIDS药物、二磷酸盐类治疗等,但是这些治疗措施结果不稳定,副作用较大,机理也不太明确。故此,我们希望在这方面能够有所突破。我们选择mTOR蛋白特异性抑制剂RAPA作为研究的重心?RAPA所具备的强效免疫抑制作用已经在临床上被用于多种疾病的治疗,如系统性红斑狼疮?中风,肺癌等?另外,RAPA还具有调节细胞自噬,抑制异体移植可能会出现的免疫排斥反应?RAPA用于HO的作用是近几年才开始被发现的?现在还不知RAPA是否还参与调节其他信号通路来抑制HO的发生和发展?作用机理到底是什么?【研究方法】1.建立AHO模型:实验开始之前,选取数量(各5只)?性别?年龄(成年,一般在3~4周)?窝别?体重?活动情况等因素相匹配的NSE-BMP4实验小鼠,分为对照组和实验组?在实验第一天,所有小鼠左腿肌肉注射一次等量的的(100ng/100μl)的心脏毒素(cardiotoxin,CTX)作为损伤条件,以损伤1周?2周?4周的组织作为创伤性HO的早?中?后期阶段来观察,以此创建创伤性HO的小鼠模型?2.给药:实验组小鼠在用CTX损伤后,腹腔注射已被溶解和稀释的RAPA(100μg/100μl),每隔一天给药一次,对照组给予溶剂,给药剂量?方法?时间等情况与实验组小鼠相同?3.X光:给药结束后,将实验鼠在麻醉的情况下于小动物成像仪(型号FX PRO)里进行X光拍摄,观察损伤部位异位骨生长情况,比较实验组和对照组的差异?4.对小鼠进行眼球取血:于安徽医科大学第一附属医院检验科进行WBC数目和分型检测(日本希森美康XS-800i五分类血细胞分析仪)?5.免疫荧光检测:取HO不同时相的小鼠损伤部位组织,先制作成冰冻切片,然后选取特异的靶蛋白的抗体以及相应的荧光二抗进行免疫荧光染色?6.组织Western Blot:检测实验组和对照组小鼠的损伤部位组织中靶蛋白如Hif1a的表达差异?【研究结果】1.影像学结果显示:与对照组相比,给予RAPA的实验组经损伤后出现的异位骨明显减少,并在一定的剂量范围内呈现剂量依赖性?2.外周血白细胞计数和分型检测结果显示:相比较于对照组,给予RAPA的实验组外周血WBC明显降低,且差异具有统计学意义?3.免疫荧光结果显示:RAPA可以降低损伤部位P-mTOR的表达?4.RAPA可以通过抑制Hif1a的表达来抑制HO?5.氧化应激伴随着异常免疫反应参与HO早期的纤维增生阶段的进展?6.RAPA可以降低HO损伤区域中血管的形成?【结论】氧化应激伴随着异常免疫反应,参与HO的早期阶段,而雷帕霉素可以通过降低mTOR蛋白的表达,缓解低氧环境,抑制mTOR信号和氧化应激来抑制HO的发生。