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前言 血管新生在实体肿瘤的生长、浸润及转移的过程中起着至关重要的作用。最近发现血液系统恶性肿瘤中也存在血管新生现象，如急性非淋巴细胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)、急性淋巴细胞性白血病(Acute lymphocytic leukemia，ALL)、多发性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)等。 血管内皮生长因子(Vascular endothelium growth factor，VEGF)是最重要的促进血管生成的因子之一，具有增加血管通透性、促进内皮细胞移行和增殖等作用。一个体外细胞培养实验证实一些恶性血液病细胞系表达VEGF及其受体，Fiedler等还发现初诊AML患者外周血或骨髓单个核细胞VEGF表达量比正常骨髓细胞及富含CD34~+细胞明显高。本实验应用免疫细胞化学及流式细胞术的方法检测了初诊急性白血病患者骨髓或外周血单个核细胞VEGF蛋白的表达情况，以明确急性白血病细胞是否高表达VEGF，以及VEGF在急性白血病发病过程中是否起重要作用。 材料和方法 一、临床资料 初诊急性白血病患者59例，其中AML31例，ALL28例，诊断符合FAB标准。平均年龄40.5(15-75)岁。以14例骨髓正常者做对照组。 二、外周血或骨髓单个核细胞分离 3-5ml肝素抗凝的外周血或骨髓，应用密度梯度离心法分离单个核细胞，所得细胞中白血病细胞比例大于90％。 三、免疫细胞化学方法检测VEGF表达 离心涂片机作细胞涂片，－40℃保存，采用SAP方法检测。保存的细胞涂片冷丙酮固定10分钟，山羊血清室温封闭30分钟，然后加人20 pl兔抗人VEGF多抗O：100乃7℃孵育2小时，再依次加人生物素化羊抗兔二抗和SAP复合物37℃孵育30分钟，坚固红显色 5－10分钟，苏木素复染 2分钟。以 PBS代替一抗作阴性对照。光学显微镜下观察计数阳性细胞数。细胞浆染成淡粉色至深红色的为阳性细胞，阳性细胞数大于20％判定为阳性。 四＼流式细胞术方法检测VEGF表达量 对其中30例白血病标本和9例对照组标本应用流式细胞术方法检测VEGF的表达量。分离的单个核细胞，70％冷乙醇固定，－20℃保存。检测时 4℃离心弃乙醇，PBS洗两次，二％小牛血清封闭3o分钟，加人免抗人＊＊肝多抗（终浓度互：IM）室温孵育2小时，朋S洗两次后再加人n知标记的羊抗免二抗（终浓度1：100）室温避光孵育30分钟，PBS洗两次，重新悬浮细胞，上机检测。以PBS代替一抗作阴性对照。以平均荧光强度（Mean luo－rescence intensity，MFI）表示VEGF的表达量： MFI一加一抗细胞的荧光强度一阴性对照细胞的荧光强度。 五、流式细胞术进行细胞周期分析 70％冷乙醇固定的细胞4℃离心弃乙醇，PBS洗两次；加人IInl含RNA酶p004牙rnl）的PBS，37℃孵育30分钟，离心弃RNA酶，冷 PBS洗两次；加人含碘化丙陡（终浓度 10pg／Inl）的 PBS 0．5rnl，4T避光染色30分钟；离心弃染液，PBS重新悬浮细胞，上机检测。以增殖指数（Proliferation index刀）表示细胞的增殖状态： （G。M＋S）细胞数 PI＝HH：＝＝＝＝＝－－－ “（G。；＋Gi M＋S）细胞数 六、统计：应用 SPSS统计分析软件，两组间率的比较用 x‘检验，MFI的比较用秩和检验，MFI经对数转换后用一元线性回归法分析其与PI之间的相关性。 ·2· 结 果 一、免疫细胞化学 59例初诊急性白血病患者中有 31例 VEGF呈阳性表达，阳性率为52．5％门 l／5 9），而正常对照组阳性率为14．3％p八4八二者相比具有显著差异，X‘＝6．686，P＜o＊二。 31例AML患者中有ZI例呈阳性表达，阳性率为67．7％p／31），显著高于 ALL组的阳性率（35．7畅，10／28），X‘＝6．052，P＜0．05。 二、流式细胞术 30例急性白血病患者的 V”EGF MFI（中位数：2．405；均值：4．075；P。－P，。：0．553－4．965）显著高于 9例正常对照组标本的MFI（中位数＊．000；均值：0．65。4；P25－Pv。＊．000－0．865），Z＝3．113，P＜0．01。＊＊L患者的＊＊＊F＊n（均值：4．394；中位数：3．230；PU－P，。＊．580－4．290）高于 ALL患者的 MFI（均值：3．026；中位数：2．180；Ps－Pv引0．000－7．290厂但二者相比无统计学差异。 流式细胞术与免疫细胞化学方法具有良好的一致性，Kendall相关系数一0．409，P＜0．of；K81。ps值 一一 0．389，P＜0．05。 VEGF表达量（MFI）与白血病细胞的增殖指数河I）呈对数正相关，n二23．2的。2．7831n＊n，相关系数r＝o．M8，P＜o．05。吕随着 VEGF表达增高，细胞增殖指数呈增加趋势，即细胞增殖旺盛，增殖期细胞增多。 讨 论 血管新生在恶性实体肿瘤的发病、浸润及转移的过程中起重要作用。实体肿瘤当体积增至l－ZInln时，如无新生血管长人，肿瘤组织将保持休眠状态或发生退化。新生血管一方面给肿瘤组织