论文部分内容阅读
MAP30(momordica anti-HIV protein of30 kDa)是一种分子量为30 kDa的Ⅰ型核糖体失活蛋白，具有抗病毒、抗菌、抗肿瘤活性，且能够特异诱导肿瘤细胞凋亡，对未感染的正常二倍体细胞几乎无毒性，不易产生耐药性，是一种很有前景的新型抗肿瘤、抗病毒候选药物。研究发现水解全长MAP30蛋白后得到小片段蛋白仍然具有全长MAP30抗肿瘤、抗HIV的活性，但是没有核糖体失活活性，说明MAP30的抗肿瘤、抗病毒和抗菌活性可能是由蛋白的不同部位所控制的，克隆其与抗肿瘤、抗病毒活性的相关区段基因并进行表达，这有利于获得低毒副作用、高活性的基因工程产品。
本研究通过PCR技术，从质粒pET30a-MAP30中克隆得到编码M1(D1-K195)、M2(D1-E187)、M3(A11-K195)、M4(A11-E187)四个功能区段缺失体蛋白的序列，经测序鉴定后亚克隆到原核表达载体pET22b中，表达载体用CaCl<,2>介导的化学转化法转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，然后利用菌落PCR筛选阳性克隆。工程菌在28℃时经lmM IPTG诱导5h时实现高效表达，可溶性分析表明四种重组蛋白在大肠杆菌中都以包涵体形式存在。利用MTT法分析四个重组蛋白复性液的抗肿瘤活性，结果表明四个功能区段缺失体重组蛋白均对人羊膜细胞系wish、鼠髓白血病细胞系NFS-60、小鼠腹水瘤细胞S-180有杀伤作用，其中对鼠髓白血病细胞系NFS-60抑制作用最明显。M1、M2、M3和M4四个缺失体重组蛋白对NFS-60作用的半致死量分别为2.51μg/ml、2.42μg/ml、1.89μg/ml和1.90μg/ml。细胞毒性分析表明，四个重组蛋白对人正常肝细胞系HL-70的细胞毒性极小，其中M3的细胞毒性较其它三者低，且低于MAP30细胞毒性。
通过大肠杆菌制备的重组四个功能区段缺失体蛋白中以M3的抗肿瘤效果最佳，也优于全长MAP30，并且M3对正常细胞的细胞毒性亦最低。M3不包括MAP30核糖体失活活性的C端序列，对人体毒副作用更低，并且较全长MAP30蛋白减少了近100个氨基酸，预计制成基因工程药物后将更有利于人体的吸收利用，降低抗原抗体反应。因此功能区段缺失体蛋白M3是不仅具备MAP30优点，而且应用优势上优于MAP30，具有很大的临床应用价值和市场开发前景。