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H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)对家禽表现为低致病性,引起呼吸道症状、产蛋下降等轻微症状,感染鸡排毒时间长,如若继发感染其它病原体死淘率将增加,造成养禽业严重的经济损失。近年来,不断有H9N2亚型AIV感染人的病例出现,甚至有患者病情严重,H9N2病毒对哺乳动物致病力的机制的研究与其它亚型禽流感病毒相比相对较少。H9N2亚型AIV具有流行范围广、传播效率高的流行特点,而且能够提供内部基因给其它亚型流感病毒产生重组病毒,具有大流行的风险,应对其进行长期监测和病原特点分析。本研究对2016年10月至2018年9月期间华东地区活禽交易市场(Live poultry markets,LPMs)和家禽养殖场进行了禽流感病毒流行病学监测,并对H9N2亚型AIV进行了病毒的分离鉴定和基因测序,同时选取了代表性H9N2亚型AIV进行了传播性试验、S基因型H9N2亚型AIV进行了小鼠的致病性试验。1、H9N2亚型禽流感病毒病原学调查2016年10月至2018年9月期间,在华东地区LPMs共采集泄殖腔/喉头棉拭子样品2183份,经SPF鸡胚分离和血凝-血凝抑制试验鉴定了 518株AIV和NDV病毒,病毒总阳性分离率为23.73%,其中H9N2亚型252株(11.54%,252/2183);养鸡场疑似H9N2临床样品中分离鉴定156株H9N2亚型AIV。LPMs病毒阳性样品中H9N2病毒分离率最高(48.65%,252/518),其次是 H5 亚型(21.81%,113/518)、H3 亚型(14.1%,73/518)、H7亚型(4.83%,25/518)等。2011年7月到2016年9月(统计周期约为12个月)分离率在 0.21%-0.78%,2016 年 10 月至 2018 年 9 月为 8.49%-15.12%,LPMs 中 H9N2 亚型AIV阳性分离率有明显上升。鸡仍然是H9N2亚型AIV的易感宿主;样品主要来源于华东地区江苏、安徽、山东等省市;近两年LPMs中的H9N2亚型AIV在夏季亦有较高的分离率,未表现出明显的季节性流行特征,可能与病毒的热稳定性增强有关。2、华东地区家禽中流行的H9N2亚型禽流感病毒的遗传进化特征本文对测得的394个HA基因、302个NA基因、69组内部基因的核苷酸及其编码氨基酸进行了系统性分析,并选取其中具有代表性的69个分离株绘制出全基因系统发生树进行遗传进化分析。运用MEGA6.0邻接法(neighbor-joining method,NJ)绘制出了各基因片段的系统发生树,经分析,HA基因、NA基因均属于Y280-Like,内部基因PB2基因、M基因属于G1-Like,其余4个内部基因均属于F/98-Like,本研究中的H9N2亚型分离株均属于S基因型。H9N2分离株潜在糖基化位点与2012年分离株WJ57基本一致,389个分离株(389/394)HA蛋白具有7个潜在N-糖基化位点(HA1:11,123,280,287,295;HA2:154,213),与Y280相比,缺失了 HA1 200位糖基化位点,增加了 HA1 295位糖基化位点;294株(294/302)病毒NA蛋白具有5个潜在N-糖基化位点(69,86,146,200,234),与WJ57/12相似。其中,有11(11/302)个分离株增加了 NA蛋白第44位、14(14/302)个增加了第402位潜在N-糖基化位点。可影响病毒的受体结合特性的HA蛋白226位几乎(392/394)均发生了 Q→L突变,更倾向于结合哺乳动物受体。前期研究表明HA蛋白381K与PA蛋白672L是影响H9N2亚型AIV气溶胶传播特性的关键氨基酸位点,本研究中6个毒株(6/394)发生了 K381R的突变,PA蛋白第672位均为L。PA蛋白K356R、PB2蛋白E627K是影响H9N2亚型AIV对哺乳动物致病性的重要的氨基酸位点,本研究中所有的分离株PB2蛋白均为627E、PA蛋白均为356R。3、H9N2亚型禽流感病毒传播特性及致病性初步研究2016年以来H9N2病毒在鸡群中分离率明显上升,且不断有人感染病例报道,不同基因型毒株传播能力、致病性是否不同,目前还没有系统的研究。从近12年H9N2亚型AIV中筛选出16株进行气源性传播试验,包括3株O基因型(SD07、W4和Dh0801D11),1株T基因型(HeN86),和12株S基因型。16株病毒中符合HA381K和PA672L的毒株有W4、HeN86、C1、HeN131、SQ68、WJ57、TM118、SDKD1、AH320、AH463、FJ1802 和 292HZ共12株。S基因型H9N2亚型AIV均具有气源性传播特性,即使GC510、A6的HA蛋白381为R,但是2008年分离株C1只能检测到血清转化而无排毒;其它基因型毒株中除HeN86具有上述分子标记但无气溶胶传播特性,其余病毒均符合。近两年的S基因型毒株气源性传播能力增强,暴露组排毒时间早、排毒持续时间长(第9天)、血清转化水平高;AH320和SDKD1毒株可跨宿主传播(鸡-豚鼠),而且在检测期范围内暴露组豚鼠排毒直到暴露后14天。8个S基因型H9N2亚型AIV对小鼠低致病性,体重增长率在17.06%-22.89%,均有不同程度的增重降低,SDKD1组增重最少。病毒复制水平和组织分布差异明显,主要在肺脏复制,特别是攻毒后第3天和第5天,部分毒株在心脏、肾脏、肝脏和脾脏中亦能检测到病毒。感染后第3天、5天,各个攻毒组小鼠肺脏均呈现出以瘀血、出血、肺泡间质增生或广泛的炎性细胞渗透等间质性肺炎变化。因此,S基因型病毒普遍具有气源性传播能力、对小鼠低致病性但可从鸡传播给豚鼠,且在小鼠中组织分布更广,提示对公共卫生可能存在威胁。