目的:采用传统药理学、网络药理学和分子生物学等评价方法,从收缩压、心率、宏观表征、行为学、微观理化指标和病理诊断等多个方面全方位综合评价五味降压散的药效;在确定五味降压散降压药效的基础上,以目前与高血压发病机制密切相关的靶点ACE、ACE2为切入点,同时结合网络药理学预测的药物作用靶点AR、ER,采用实时荧光定量PCR技术和蛋白免疫印迹(Western blot)技术,初步探索五味降压散的降压机制,为五味降压散抗高血压病提供科学依据,为中药复方抗高血压病的药效机制研究提供新的思路和方法。方法:1.动物药效学评价:采用血压、心率、体重、宏观表征、微观理化指标及病理诊断为依据,选择14周龄的SHR大鼠,根据初始血压及体重分组,随机分为模型组,五味组,三草组,牛黄组,缬沙坦组,WKY为正常对照组,连续给药10周;运用BP-2010A大小鼠尾动脉智能无创血压计测量大鼠收缩压和心率,每周定时监测2次。密切观察给药后SHR大鼠的基本情况变化,同时进行每周一次的体重测量、易激惹程度评分、旋转耐受时间测试等;实验结束后,腹主动脉取血,分离和制备血清,做生化检测;研究五味降压散对大鼠血液相关指标的影响;进行实验动物靶器官的病理检查诊断,将取材所得心、肾组织浸蜡包埋,切片,HE染色,中性树胶封片,显微镜下观察、照相。观察大鼠组织的病理形态学改变情况,探索五味降压散对心脏和肾脏的病理改变,以综合评价五味降压散的降压效果。2.五味降压散降压机制初步探讨:运用分子生物学和网络药理学评价方法,采用实时荧光定量PCR技术和Western blot技术研究SHR大鼠心脏和肾脏ACE、ACE2基因和蛋白的表达水平;同时检测心脏和肾脏中AR、ERα蛋白的表达水平,以验证课题组前期网络药理学预测的准确性,即五味降压散是否通过调节AR、ERα而降压。结果:1.五味降压散的药效学:(1)对收缩压的影响:给药10周时:模型血压持续上升;五味组在给药2周时起效明显,血压明显下降,到4周后血压维持平稳低水平;三草组在给药0-4周内起效,4-8周血压回升,8周后血压呈下降趋势;牛黄组在给药0-1周,4-8周内有效;缬沙坦组持续降压。(2)对心率的影响:五味组与模型组具有统计学差异,模型组心率明显升高,而五味组给药后心率维持稳定状态。(3)对体重的影响:模型组体重增加迅速,五味组体重增加缓慢且幅度最小。(4)对行为学的影响:①易激惹程度:五味降压散给药5周后易激惹程度趋于稳定;②旋转耐受时间:五味组在给药2周后旋转耐受时间增长,并一直趋于稳定,这与血压的降低趋势是一致的。(5)对一般表征的影响:五味降压散组大鼠的扎堆攀打、抓取尖叫、弓背、狂躁、固定困难、小便深黄、大便干硬且量少等症状跟随血压波动而变化:血压升高,表征明显加重。血压下降,诸症减弱,如各自爬卧减少、抓取尖叫程度减轻甚至无抓取无反抗、小便清长、大便量逐渐增多、大便稀软等;而模型组则是诸症较给药前日益加重,差异明显。(6)对血常规的影响:与模型组比较,LYM%上升、MID下降、MID%下降、RBC上升、HCT上升、MCH下降、MCHC下降;差异有统计学意义,P<0.05。(7)对血脂的影响:与模型组比较:五味组的总胆固醇CHOL、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、甘油三酯TG均降低,差异显著(P<0.05)。(8)对心脏、肾脏病理改变的影响:模型组大鼠心肌血管内瘀血,小动脉肌层明显增厚,细胞大小不均匀、不规则,细胞有空泡变性,血腔变窄。肾脏肾小球有增大,瘀血明显,部分基底膜轻度增厚,包氏囊有渗出,曲管肿胀,有网眼样改变,间质有炎症浸润。而五味组大鼠心、肾病变与模型组脏器的损害比较相对的减轻。2.五味降压散的作用机制:(1)对大鼠心脏和肾脏ACE、ACE2基因表达的影响:与模型组相比,五味组能下调SHR大鼠心脏ACE基因表达水平,上调ACE2基因表达水平,P<0.01。五味组心脏ACE2和ACEmRNA与正常组比较差别不明显(P>0.05)。正常组、模型组、五味组.和缬沙坦组四组的肾脏ACEmRNA表达差别不大(P>0.05),说明五味降压散对肾脏ACE mRNA无明显影响。五味组的SHR大鼠ACE2基因表达水平与正常组比较差距不大(P>0.05);但与模型组比,五味组能上调肾脏ACE2基因水平,P<0.05。(2)对大鼠心脏和肾脏ACE、ACE2和ERα、AR蛋白表达的影响:①五味组心脏ACE、ACE2蛋白表达与正常组相别,差别不大(P>0.05);与模型组相比,五味降压散能上调心脏ACE2蛋白(P<0.05),与上调心脏ACE2mRNA结果一致。②与模型组相比,五味组的心脏和肾脏AR、ERα蛋白表达差异不大(P>0.05)。结论:1.五味降压散的药效学特点:(1)降压平稳持续,后期更优:五味降压散起效较慢,但其稳压优势在后期比较明显,且后期优于三草降压汤和牛黄降压丸。五味降压散降压持续、平稳、波动幅度小。而模型组血压持续上升,五味组降压作用与模型组相比,差别显著(P<0.05)。(2)稳定心率:模型组心率明显升高,而五味组给药后心率维持稳定状态。五味降压散给药2周后,心率和血压均下降并保持稳定,且变化趋势呈现一致性。(3)减缓体重增长:模型组体重增加迅速,五味组体重增加缓慢且幅度最小。(4)镇静:五味降压散组较模型组易激惹程度低且平稳,波动性小;五味降压散组旋转耐受时间增长,并一直趋于稳定,较模型组变化幅度小。二者变化趋势与降压趋势基本一致。(5)改善表征:五味降压散在降压的同时能够改善SHR大鼠的高血压伴随症状,如抓取反抗、尖叫、固定困难等随血压的下降而减弱,大便量逐渐增多,质地从硬到逐渐变软,小便少而黄逐渐变为量多色淡;而模型组则随血压的升高而诸症加重。(6)降脂明显:五味降压散具有明显降脂的作用,能改降低血脂相关指标CHOL、TG、LDL-C的水平。(7)保护靶器官:五味降压散能够改善心肾两脏的病理损害,能发挥一定程度的保护靶器官功能。2.五味降压散可能的降压机制:(1)调控心脏RAAS而降压:五味降压散能够降低SHR大鼠心脏ACE mRNA的水平,抑制心脏ACE的活性;同时能提高心脏ACE2基因和蛋白的含量。(2)未见对AR、ERα蛋白的表达的影响。