【摘 要】
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食源性致病菌感染是影响公共卫生安全的重要因素,食品中食源性致病菌的快速检测对保障食品安全具有重要价值。由于食品基质复杂并且病原菌的含量低,传统的食源性病原菌检测需要进行增菌、分离、鉴定等步骤才能完成检测,检测时间长,操作繁琐,步骤复杂,在实际检测中表现出一定的局限性。样品前处理过程中食源性病原菌的有效富集,将会极大地提升后期检测结果灵敏度。抗菌肽(antimicrobial peptides,AM
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食源性致病菌感染是影响公共卫生安全的重要因素,食品中食源性致病菌的快速检测对保障食品安全具有重要价值。由于食品基质复杂并且病原菌的含量低,传统的食源性病原菌检测需要进行增菌、分离、鉴定等步骤才能完成检测,检测时间长,操作繁琐,步骤复杂,在实际检测中表现出一定的局限性。样品前处理过程中食源性病原菌的有效富集,将会极大地提升后期检测结果灵敏度。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)是具有广谱抗菌活性的短肽,可以广谱的与细菌细胞膜结合。本研究利用AMPs与细胞膜结合这一特点,尝试将抗菌肽用于食源性致病菌的捕获,并结合多重PCR(multiplex PCR,mPCR)实现同时检测Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Shigella和Pseudomonas aeruginosa 5种食源性致病菌。首先,通过生物信息学手段筛选得到S.aureus,E.coli,Shigella和P.aeruginosa的特异基因,并借鉴Tian等人(2019)报道的K.pneumoniae特异基因,经Primer Explorer V5设计5对特异引物,PCR特异性评估验证表明5种特异基因可作为检测S.aureus,E.coli,Shigella,K.pneumoniae和P.aeruginosa 5种食源性病原菌的靶标基因。以5种特异基因为基础,建立mPCR方法实现对S.aureus,E.coli,Shigella,K.pneumoniae,P.aeruginosa的同步检测,其检测限分别为102 CFU/m L、103 CFU/m L、102 CFU/m L、102 CFU/m L、102 CFU/m L。其次,利用抗菌肽Cathelicidin-DM与细菌细胞膜表面结合的特点,将Cathelicidin-DM设计成为广谱的细菌捕获元件。第一步,用激光共聚焦显微镜观察FITC标记的Cathelicidin-DM与细菌的结合作用。用磁珠-ELISA方法进一步验证抗菌肽Cathelicidin-DM有捕获细菌的效果,两种方法验证结果证明可以将抗菌肽Cathelicidin-DM设计为食源性致病菌的捕获元件。第二步,建立PMAxx-q PCR方法对IMS偶联SMAP-29、BMAP-27、Cathelicidin-DM、Chicken CATH-2 4种不同抗菌肽捕获5种靶标细菌进行定量分析,其中Cathelicidin-DM对E.coli,K.pneumoniae,P.aeruginosa,Shigella,S.aureus的捕获效果最好,捕获率分别为92.69%、85.82%、84.33%、91.59%、78.87%。最终,将抗菌肽Cathelicidin-DM捕获细菌与mPCR检测结合,建立完整的检测方法。比较抗菌肽捕获结合mPCR检测方法与普通PCR检测方法检测人工污染细菌的苹果汁的检测限,本研究建立的抗菌肽捕获结合mPCR检测方法的检测限明显高于普通PCR检测方法。其对E.coli,S.aureus,Shigella,P.aeruginosa,K.pneumoniae的检测限为101 CFU/m L、102 CFU/m L、101 CFU/m L、101 CFU/m L、101 CFU/m L。综上,本研究建立的抗菌肽捕获结合mPCR快速检测食源性致病菌的方法可快速、灵敏、准确检测E.coli,S.aureus,Shigella,P.aeruginosa,K.pneumonia 5种食源性致病菌。
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