周围神经再生和功能修复是尚未解决的临床难题。对于短节段的神经损伤,可以将断裂的神经直接对端吻合,使近端再生的神经纤维能长入远端。但对于长节段的神经缺损,临床上无法进行无张力缝合,目前治疗的金标准是将未损伤区域的自体神经移植到损伤区域来桥接损伤的神经断端。然而,应用自体神经移植受到很多因素限制:获取供体神经需要二次手术,供区神经来源不足,继发的供区神经功能丧失,以及供受神经在组织结构和尺寸上不匹配等。因此,研发能够有效代替自体神经的移植替代物是目前亟待解决的难题。近年来,组织工程周围神经成为研究的热点。应用组织工程学方法制备组织工程移植物桥接长节段神经缺损收到较好疗效,受到了越来越多的关注。组织工程移植物一般由生物支架材料、种子细胞和生物活性因子三部分构成。其中支架作为种子细胞和神经营养因子的载体,作为组成神经损伤修复微环境的主体,其构建和性能改进研究成为制约周围神经损伤修复的关键。支架材料的组成及内部微结构是影响组织工程移植物修复长节段神经损伤的关键因素。最近研究表明,内部具有定向微结构的支架,在桥接神经缺损时比无定向结构的支架更有利于引导再生轴突的定向生长,能够促进再生神经纤维通过损伤区到达远端,证实了支架内部结构的物理引导作用对于神经再生的重要性。分析原因,主要是因为其内部定向结构模拟了正常神经基底膜的轴向微管结构。但这些支架材料在原料组成以及内部结构上,与自体神经神经基底膜的组成和结构还有很大差距,需要进一步改进。鉴于正常神经基底膜微管结构引导再生神经轴突定向生长的关键作用,如能够根据神经组织的真实组成和结构来选择和制备组织工程支架,将能够在一定程度上使该支架具备类似正常神经组织的特性,有可能会获得最理想的移植替代修复结果。然而,到目前为止,仅有少数具有类似结构的支架被报道,而应用其在体内修复实验动物长节段周围神经缺损至今未见研究报道。本实验中,选用神经基底膜基质材料——胶原为支架的主要原料,应用改良的梯度冷冻干燥技术,制备具有轴向微管结构的三维多孔支架材料。该支架在组成及内部结构方面高度仿真正常神经基底膜。随后,从原料配比、冰醋酸浓度以及冷淋速度等三方面对改良的梯度冷冻干燥技术工艺进行对比研究,筛选出最佳的制备工艺指标。为了使支架能够满足体内移植的需求,应用新型低细胞毒性交联剂——京尼平对支架进行化学交联,改善其机械强度和降解速度,并确定其最佳交联参数。在此基础上,根据国家医疗器械生物学评价的标准和要求,对本支架进行细胞相容性和组织相容性评价,结果证实本支架材料具有良好的生物安全性,可用于体内移植修复。最后,应用免疫组织学、透射电镜、神经电生理、逆行示踪技术以及评测坐骨神经指数等方法,从形态学和功能学两方面综合评价本支架桥接大鼠坐骨神经15mm缺损的修复效果,结果证实其疗效接近自体神经移植。具体内容如下:第一部分支架材料制备及最佳制备工艺参数确定目的:构建组成及结构高度仿真的组织工程神经支架方法:以细胞外基质主要成分——胶原为原料,应用改良的梯度冷冻干燥技术制备仿真支架,扫描电镜观察其结构,评测支架孔径、孔隙率等基本性能,优化其制备参数。结果:本实验制备的支架材料在组成及内部结构方面高度仿真正常神经基底膜,具备以下优点:长轴定向微管样仿生三维结构与正常神经基底膜结构高度相似,利于引导再生轴突定向生长;微管内径较为均一,管径在25μm ~ 55μm之间(平均值为37.41±11.0μm),适于神经轴突生长;平行微管间相互沟通的孔隙相连,沟通孔孔径为20.68±4.61μm,利于营养物质和代谢产物的运输;相对封闭的外壁结构,其壁厚为2.45±1.43μm,此结构在神经再生过程中,将起到瘢痕屏障的作用,能够在不影响营养物质交通的情况下,有效的阻止瘢痕纤维的长入,保护再生纤维的顺利通过。经过对比研究,确定了梯度冷冻干燥的制备最佳参数:胶原-壳聚糖混合比率为4:1,冰醋酸浓度为3mg/ml,梯度冷淋速度控制在2×10-5m/s的条件下,制备的支架材料具有最佳的三维仿生结构和良好的性能,支架平均孔隙率达90%以上。其平均孔径在30μm左右,能够满足理想支架对孔径的要求:小到能够物理性制约并有效引导再生轴突的定向生长;大到能够支持有效的血管化和再生支持细胞的渗入。第二部分支架材料改性及生物相容性评测目的:改善支架的机械性能和降解性,适应体内移植需要,并进行相容性评价为体内移植提供实验依据,奠定基础。方法:选用京尼平进行化学交联改性,考量不同交联条件下支架弹性模量、降解率等指标,优化交联参数;根据国家标准对支架的细胞相容性和组织相容性进行评价。结果:本支架应用低生物毒性交联剂——京尼平(1wt%)交联48小时处理后,无论在干或湿的状态下,其拉伸应力均高于未交联组,其弹性模量在湿的状态下达3.938±1.326 MPa,能够维持三维空间结构,对抗组织塌陷,机械性能基本满足在体移植需求。交联处理后,无论是在阴性对照液PBS中还是溶菌酶溶液中,支架在各时间点上的重量丢失比率均小于未交联组,交联支架8周PBS(无溶菌酶)溶液降解率为17.9±4.2%,溶菌酶溶液中降解率为20.1±4.6%,支架材料在神经再生过程中能够保持稳定的结构,配合神经轴突的再生。经京尼平交联的支架材料对小鼠L929成纤维细胞无直接毒性作用,其浸提液对细胞各时限的毒性评定级别均为0～1级,对细胞形态、生长和增殖不构成损害,肌肉植入法结果证实局部组织无不良反应,有良好的细胞相容性和组织相容性。第三部分支架材料修复大鼠坐骨神经缺损有效性评价目的:评价高仿真支架修复神经缺损的有效性。方法:应用免疫组织学、透射电镜、神经电生理、逆行示踪技术以及评测坐骨神经指数等方法,从形态学和功能学两方面综合评价本支架桥接大鼠坐骨神经15mm缺损的修复效果。结果:形态学观察结果显示:移植术后4周胶原-壳聚糖支架仍能够保持完整的轴向微管结构,平行的微管之间有大量再生神经纤维线性排列,沿轴向管壁定向生长;术后12周,支架材料几乎完全降解吸收,被大量成束的再生神经纤维所替代,证实了再生的神经纤维长过了桥接段。透射电镜结果:新生髓鞘比较纤细,结构完整,有许多无髓神经纤维和大量由雪旺细胞包绕形成的有髓神经纤维共存,并可观察到完整的再生血管结构和良好排列的髓鞘板层结构,再生神经轴突情况良好,修复效果接近自体神经移植。功能学检测结果显示:支架材料组的运动神经传导速度、潜伏期和波幅与自体神经移植结果接近,两组之间差异无显著性意义(p>0.05);逆行示踪标记后,在脊髓前角和背根神经节可检测到与自体神经移植组数量相当的荧光金标记阳性神经元;坐骨神经指数结果也同样证实,胶原-壳聚糖支架桥接的坐骨神经缺损功能性修复效果接近自体神经移植。