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阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是以进行性认知功能障碍和行为损害为主要临床表现的中枢神经系统退行性病变,具体表现为记忆能力降低、执行能力降低等行为的改变。随着年龄的增加,AD的发病率也逐年增加,目前我国正面临日趋严重的人口老龄化问题,60岁以上老人达到2.1亿。因此,寻求AD有效的防治疗法是亟待解决的重大问题。人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一类具有高度自我更新和分化潜能的成体干细胞,来源于脐带沃顿胶(Wharton’s Jelly)组织,具有来源广泛、低免疫反应、使用安全可靠、无伦理争议以及体外易于培养等特点,是组织工程和干细胞替代疗法的种子细胞,为AD治疗带来希望。课题组前期研究发现hUC-MSCs移植治疗AD可以改善AD的学习记忆功能,延缓衰老。但是随着传代次数的增加,干细胞不仅在形态上表现出衰老的特征,增殖和分化能力也随之减弱。因此,临床和基础研究多选用3-5代的干细胞进行移植,有限的细胞数量极大地限制了干细胞的使用。因此,研究调控干细胞衰老的关键基因,改善干细胞微环境是提高干细胞活性和疗效的关键。p16基因是美国冷泉实验室Kamb等于1993年发现的肿瘤抑癌基因,同时又是细胞周期的关键调控基因。p16能够阻遏周期蛋白D(cyclinD)与周期蛋白依赖性蛋白激酶4/6(CDK4/CDK6)的结合,抑制视网膜母细胞瘤(RB)的磷酸化,而未磷酸化的RB则不能与E2F结合启动DNA的复制,从而将细胞周期阻断在G1/S检查点,导致细胞周期停滞。课题组前期研究发现p16基因高表达能导致293细胞的衰老,但是p16与hUC-MSCs和AD鼠的衰老关系还不清楚。因此,本课题通过体内体外实验研究p16表达下调对hUC-MSCs和APP+鼠衰老的调控。目的本研究以p16基因为切入点,以慢病毒为载体,利用RNAi技术下调P15hUC-MSCs中p16基因的表达,进而观察p16基因表达下调对hUC-MSCs衰老的影响;同时,在体内实验中,以APP+鼠为研究对象,研究p16表达下调的p15huc-mscs对app+鼠的神经修复和抗衰老作用。方法1靶向下调p16基因表达的sirna片段的筛选和慢病毒构建取剖腹产健康新生儿脐带,体外分离培养huc-mscs,流式细胞仪检测huc-mscs细胞表面标记物cd44、cd90、cd34和cd45的表达,收集3、10、15代的细胞,qrt-pcr检测p16的表达,β-半乳糖苷酶染色检测不同代数huc-mscs的衰老程度。筛选有效下调p16基因表达的sirna(sip16),构建包含sip16的慢病毒(lv-shp16),lv-shp16感染huc-mscs观察绿色荧光表达以及检测p16蛋白表达。2p16基因表达下调对huc-mscs衰老的影响体外实验分为四组,分别为p3组、p15组、lv组和lv-shp16组。cck-8法检测各组细胞的增殖;pi染色和fitc染色检测各组细胞的周期和凋亡;β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞的衰老状态;qrt-pcr和westernblot检测各组细胞中细胞周期关键基因(cdk4、cdk6、rb1、p-rb1)以及衰老相关基因(p16、p53、p21、pcna、sirt1、sirt2)的表达变化。3p16表达下调的huc-mscs对app+鼠神经功能的修复作用体内实验中,取4月龄app+雄鼠40只,随机分为5组,分别为p3huc-mscs移植组(p3组)、空白组(ad组)、p15huc-mscs移植组(p15组)、lv感染的p15huc-mscs移植组(lv组)、lv-shp16感染的p15huc-mscs移植组(lv-shp16组),同时以遗传背景相同的非转基因的野生鼠作为正常对照组(wt组)。p3组、p15组、lv组、lv-shp16组均采用尾静脉注射huc-mscs的方式治疗,每只app+鼠注射细胞量为1x106个cell/200ul,每周注射一次,连续注射四周,其余各组注射生理盐水。细胞移植28天后,morris水迷宫实验检测小鼠行为学的改变;心脏取血,tba法和羟胺法检测小鼠血清中丙二醛(malondialdehyd,mda)和超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,sod)的活力变化;免疫组化检测小鼠脑组织mab1281的表达,检测双肾上腺皮脂激素(dcx)、βⅢ微管蛋白(βⅢ-tubulin)以及淀粉样前体蛋白(app)的表达;提取小鼠海马组织rna和蛋白,qrt-pcr和westernblot检测细胞周期关键基因(cdk4、cdk6、rb1、p-rb1)、衰老相关基因(p16、p53、p21、pcna、sirt1、sirt2)、凋亡相关基因(caspase-3、bcl-2)以及tau、p-tau的表达变化。结果1、随着传代次数的增加,huc-mscs细胞逐渐呈现出形态扁平化,易脱壁的特点,β-半乳糖苷酶染色发现阳性细胞率明显增加(p<0.05);qrt-pcr结果显示p3、p10、p15huc-mscs中p16mrna的表达逐渐增加(p<0.05)。2、成功筛选出能有效下调p16表达的sirna,合成包含此sirna的慢病毒并成功感染huc-mscs;与p15组相比,lv-shp16能促进p15huc-mscs的增殖、促使细胞周期进入s期、抑制p15huc-mscs的早期凋亡、降低huc-mscs的衰老程度(p<0.05);同时,lv-shp16组中p16、p53、p21mrna和蛋白表达降低,rb1mrna和蛋白表达不变,而pcna、sirt1、sirt2、cdk4、cdk6、p-rb1mrna和蛋白表达升高(p<0.05)。3、细胞移植期间,app+鼠生长状态良好,无不良反应;与ad组相比,各处理组均有一定的抗衰老作用;与p15组相比,lv-shp16组小鼠逃避潜伏期减少、逃避潜伏期距离缩短,穿越平台次数、第一象限停留时间增加(p<0.05);lv-shp16组血清sod活力升高,mda活力降低(p<0.05);lv-shp16组海马组织中p16、p53、p21、caspase-3、p-tau蛋白表达降低,pcna、sirt1、sirt2、cdk4、cdk6、p-rb1、bcl-2蛋白表达升高(p<0.05),rb1、tau蛋白表达变化不明显;此外,lv-shp16组脑组织中mab1281阳性细胞明显增多,dcx、βⅢ-tubulin的表达增加,而app的表达减少(p<0.05)。结论1、随着细胞传代次数的增加,huc-mscs开始出现衰老,p16的表达与衰老呈正相关。2、下调p15huc-mscs中p16基因的表达能调节细胞周期关键基因(cdk4、cdk6、p-rb1)以及衰老相关基因(p53、p21、pcna、sirt1、sirt2)的表达,延缓和改善huc-mscs的衰老,促进huc-mscs的增殖。3、通过调节cdk4、cdk6、p-rb1、p53、p21、pcna、sirt1、sirt2等基因的表达,LV-shp16能促进hUC-MSCs的迁移和神经分化、抑制神经细胞凋亡,进而改善hUC-MSCs对APP+鼠的治疗效果。